Et In vitro-system til at måle den trombolytiske effekt af histotripsi og et lytisk lægemiddel

Summary

Histotripsi-aided lytic levering eller lysotripsi er under udvikling til behandling af dyb venetrombose. En in vitro-procedure præsenteres her for at vurdere effekten af denne kombinationsbehandling. Nøgleprotokoller for blodpropmodellen, billedvejledningen og vurderingen af behandlingseffektiviteten diskuteres.

Abstract

Dyb venetrombose (DVT) er et globalt sundhedsmæssigt problem. Den primære tilgang til at opnå recanalisering af fartøjer for kritiske forhindringer er kateterstyret trombolytika (CDT). For at afbøde kaustiske bivirkninger og den lange behandlingstid forbundet med CDT, adjuvans og alternative tilgange er under udvikling. En sådan tilgang er histotripsi, en fokuseret ultralydsbehandling for at ablate væv via bobleskynukleation. Prækliniske undersøgelser har vist stærk synergi mellem histotripsi og trombolytika for blodprop nedbrydning. Denne rapport skitserer en bordplade metode til at vurdere effekten af histotripsi-aided trombolytisk behandling, eller lysotripsi.

Blodpropper fremstillet af frisk humant venøs blod blev indført i en flowkanal, hvis dimensioner og acousto-mekaniske egenskaber efterligner en iliofemoralsk vene. Kanalen var gennemsyret af plasma og lytic rekombinant væv-type plasminogen aktivator. Bobleskyer blev genereret i blodproppen med en fokuseret ultralydskilde designet til behandling af lårvenvenøse blodpropper. Motoriserede positioners blev brugt til at oversætte kilden fokus langs blodproppen længde. På hvert insonationssted blev akustiske emissioner fra bobleskyen passivt registreret og stråleformet for at generere passive kavitationsbilleder. Målinger til måling af behandlingseffekten omfattede blodprop massetab (samlet behandlingseffekt) og koncentrationerne af D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) i perfusat. Der er begrænsninger for denne in vitro design, herunder manglende midler til at vurdere in vivo bivirkninger eller dynamiske ændringer i strømningshastighed som blodproppen lyses. Samlet set giver opsætningen en effektiv metode til at vurdere effekten af histotripsi-baserede strategier til behandling af DVT.

Introduction

Trombose er tilstanden af blodprop dannelse i en ellers sund blodkar, der hindrer omsætning^1,2. Venøs tromboemboli har en årlig sundhedsudgifter på $7-10 milliarder, med 375,000-425,000 tilfælde i USA³. Lungeemboli er obstruktion af lungepulsåren og er den mest alvorlige konsekvens af venøs tromboemboli. Den primære kilde til lungeobstruktion er dyb vene thrombi, primært fra iliofemoral venøse segmenter^4,5,6. Dyb venetrombose (DVT) har iboende følgevirkninger udover lungeobstruktioner, med langsigtede komplikationer, der resulterer i smerte, hævelse, bensår og amputationer af^{lemmerne 7,8,9}. For kritiske forhindringer, kateter rettet trombolytics (CDT) er frontlinjen tilgang til fartøj recanalization¹⁰. Resultatet af CDT afhænger af en række faktorer, herunder trombe alder, placering, størrelse, sammensætning, ætiologi, og patientrisiko kategori¹¹. Desuden er CDT forbundet med vaskulær skade, infektioner, blødningskomplikationer og lang behandlingstid¹⁰. Næste generations enheder har til formål at kombinere mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmakkomesisk trombektomi)^12,13. Brugen af disse enheder sænker den lytiske dosis, hvilket fører til reducerede blødningskomplikationer, og forkortede behandlingstiden^12,13,14 sammenlignet med CDT. Disse enheder stadig bevare problemer med hæmoragiske bivirkninger og ufuldstændig fjernelse af kronisk thrombi¹⁵. En adjuvans strategi er derfor nødvendig, der kan fjerne tromben helt med lavere blødning komplikationer.

En potentiel tilgang er histotripsi-aided trombolytisk behandling, benævnt lysotripsi. Histotripsi er en ikke-invasiv behandling modalitet, der bruger fokuseret ultralyd til at nukleate boble skyer i væv¹⁶. Bobleaktivitet genereres ikke via eksogene kerner, men ved anvendelse af ultralydsimpulser med tilstrækkelig spænding til at aktivere kerner iboende væv, herunder blodprop^17,18. Den mekaniske svingning af bobleskyen giver stammen til blodproppen og opløser strukturen i acellulære snavs¹⁹. Histotripsi boble aktivitet giver effektiv nedbrydning af tilbagetrukne og unretracted blodpropper både in vivo og in vitro^20,21,22. Tidligere undersøgelser har^23,24 påvist, at kombinationen af histotripsi og lytic rekombinant vævstype plasminogen aktivator (rt-PA) øger behandlingseffektiviteten (rt-PA) betydeligt i forhold til lytic alene eller histotripsi alene. Det er en hypotese, at to primære mekanismer forbundet med histotripsi boble aktivitet er ansvarlige for den forbedrede behandling effekt: 1) øget fibrinolyse på grund af øget lytic levering, og 2) hæmolyse af røde blodlegemer i blodproppen. Hovedparten af blodproppen består af røde blodlegemer²⁴, og derfor er sporing af erythrocyt nedbrydning en god surrogat for ablation af prøven. Andre dannede blodprop elementer er også sandsynligvis opløst under histotripsi boble aktivitet, men er ikke taget i betragtning i denne protokol.

Her er en bordplade tilgang til behandling af DVT in vitro med lysotripsi skitseret. Protokollen beskriver kritiske driftsparametre for histotripsikilden, vurdering af behandlingseffekt og billedvejledning. Protokollen omfatter designe en flow kanal til at efterligne en iliofemoral venøs segment og fremstilling af humane fuldblodspropper. Den eksperimentelle procedure skitserer placeringen af histotripsi kilde og billeddannelse array for at opnå histotripsi eksponering langs blodproppen placeret i flowkanalen. Relevante insonationsparametre for at opnå blodpropforstyrrelser og minimere off-target bobleaktivitet defineres. Brugen af ultralydsscanning til vejledning og vurdering af bobleaktivitet er illustreret²⁴. Målinger til kvantificering af behandlingseffekten, såsom massetab af blodpropper, D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) er skitseret^{23,24,25,26,27}. Samlet set giver undersøgelsen et effektivt middel til at udføre og vurdere effekten af lysotripsi til behandling af DVT.

Protocol

For de resultater, der præsenteres her, venøse humane blod blev trukket til at danne blodpropper efter godkendelse fra den lokale interne review board (IRB # 19-1300) og skriftligt informeret samtykke fra frivillige donorer24. I dette afsnit skitseres en designprotokol til vurdering af lysotripsieffekten. Protokollen er baseret på et tidligere værk af Bollen et al.24. 1. Clot modellering BEMÆRK: Forbered blodpropper…

Representative Results

Protokollen skitseret i denne undersøgelse fremhæver detaljerne i venøs blodprop modellering, lysotripsi for blodprop forstyrrelser, og ultralydsscanning i en in vitro setup af DVT. Den vedtagne procedure viser de nødvendige skridt til at vurdere forstyrrelser i blodpropper på grund af de kombinerede virkninger af rt-PA og histotripsy boble cloud aktivitet. Bænken setup var designet til at efterligne de særlige kendetegn ved en venøs iliofemoral vene. Figur 1A viser et modelkar, der …

Discussion

Den foreslåede protokol præsenterer en model til at kvantificere behandlingseffekten af lysotripsi. Mens de vigtigste detaljer er blevet drøftet, er der visse kritiske aspekter at overveje for succesen af denne protokol. Den enzymatiske aktivitet af RT-PA har en Arrhenius temperatur afhængighed³⁰. Temperatur er også en medvirkende faktor til lydens hastighed i vand og væv, og temperaturudsving kan forårsage mindre ændringer af fokuszonens geometri. Vandtemperaturen bør således reguleres …

Materials

Absorbing sheets	Precision acoustics	F28-SMALL-M	300mm x 300 mm x 10 mm
Borosilicate Pasteur pippettes	Fisher Scientific	1367820A	14.6 cm length, 2 mL capacity
Centrifuge tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL capacity
Drabkin's assay	Sigma Aldrich	D5941-6VL
Draw syringe	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Filter bags	McMaster-Carr	5162K111	Remove particle size upto 1 microns
Flow channel tubing	McMaster-Carr	5154K25	Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4"
Heating elements	Won Brothers	HT 300 Titanium	Titanium rods placed at the bottom of tank
Imaging array	Verasonics	L11-5v	128 element with sensitivity from -55 to -49 dB
Low gelling agarose	Millipore Sigma	A9414
Model vessel	McMaster-Carr	5234K98	6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness
Nanopure water	Barnstead	Nanopure Diamond	ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity
Plasma	Vitalant	4PF000	Plasma frozen within 24 hours
Plate reader	Biotek	Synergy Neo HST Plate Reader	For haemoglobin quantification
Probe cover	Civco	610-362
Programming platform	MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA)
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA)	Genentech	Activase
Reservoir	Cole-Parmer	EW-07945-43	60 mL capacity
Syringe pump	Cole-Parmer	EW-74900-20	pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate
Transducer	In-house customized		Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network
Ultrasound scaning system	Verasonics		Vantage Research Ultrasound System
Water tank	Advanced acrylics	C133	14 x 14 x 12, 1/2"