Histotripsi-aided lytic levering eller lysotripsi er under udvikling til behandling af dyb venetrombose. En in vitro-procedure præsenteres her for at vurdere effekten af denne kombinationsbehandling. Nøgleprotokoller for blodpropmodellen, billedvejledningen og vurderingen af behandlingseffektiviteten diskuteres.
Dyb venetrombose (DVT) er et globalt sundhedsmæssigt problem. Den primære tilgang til at opnå recanalisering af fartøjer for kritiske forhindringer er kateterstyret trombolytika (CDT). For at afbøde kaustiske bivirkninger og den lange behandlingstid forbundet med CDT, adjuvans og alternative tilgange er under udvikling. En sådan tilgang er histotripsi, en fokuseret ultralydsbehandling for at ablate væv via bobleskynukleation. Prækliniske undersøgelser har vist stærk synergi mellem histotripsi og trombolytika for blodprop nedbrydning. Denne rapport skitserer en bordplade metode til at vurdere effekten af histotripsi-aided trombolytisk behandling, eller lysotripsi.
Blodpropper fremstillet af frisk humant venøs blod blev indført i en flowkanal, hvis dimensioner og acousto-mekaniske egenskaber efterligner en iliofemoralsk vene. Kanalen var gennemsyret af plasma og lytic rekombinant væv-type plasminogen aktivator. Bobleskyer blev genereret i blodproppen med en fokuseret ultralydskilde designet til behandling af lårvenvenøse blodpropper. Motoriserede positioners blev brugt til at oversætte kilden fokus langs blodproppen længde. På hvert insonationssted blev akustiske emissioner fra bobleskyen passivt registreret og stråleformet for at generere passive kavitationsbilleder. Målinger til måling af behandlingseffekten omfattede blodprop massetab (samlet behandlingseffekt) og koncentrationerne af D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) i perfusat. Der er begrænsninger for denne in vitro design, herunder manglende midler til at vurdere in vivo bivirkninger eller dynamiske ændringer i strømningshastighed som blodproppen lyses. Samlet set giver opsætningen en effektiv metode til at vurdere effekten af histotripsi-baserede strategier til behandling af DVT.
Trombose er tilstanden af blodprop dannelse i en ellers sund blodkar, der hindrer omsætning1,2. Venøs tromboemboli har en årlig sundhedsudgifter på $7-10 milliarder, med 375,000-425,000 tilfælde i USA3. Lungeemboli er obstruktion af lungepulsåren og er den mest alvorlige konsekvens af venøs tromboemboli. Den primære kilde til lungeobstruktion er dyb vene thrombi, primært fra iliofemoral venøse segmenter4,5,6. Dyb venetrombose (DVT) har iboende følgevirkninger udover lungeobstruktioner, med langsigtede komplikationer, der resulterer i smerte, hævelse, bensår og amputationer aflemmerne 7,8,9. For kritiske forhindringer, kateter rettet trombolytics (CDT) er frontlinjen tilgang til fartøj recanalization10. Resultatet af CDT afhænger af en række faktorer, herunder trombe alder, placering, størrelse, sammensætning, ætiologi, og patientrisiko kategori11. Desuden er CDT forbundet med vaskulær skade, infektioner, blødningskomplikationer og lang behandlingstid10. Næste generations enheder har til formål at kombinere mekanisk trombektomi med trombolytika (dvs. farmakkomesisk trombektomi)12,13. Brugen af disse enheder sænker den lytiske dosis, hvilket fører til reducerede blødningskomplikationer, og forkortede behandlingstiden12,13,14 sammenlignet med CDT. Disse enheder stadig bevare problemer med hæmoragiske bivirkninger og ufuldstændig fjernelse af kronisk thrombi15. En adjuvans strategi er derfor nødvendig, der kan fjerne tromben helt med lavere blødning komplikationer.
En potentiel tilgang er histotripsi-aided trombolytisk behandling, benævnt lysotripsi. Histotripsi er en ikke-invasiv behandling modalitet, der bruger fokuseret ultralyd til at nukleate boble skyer i væv16. Bobleaktivitet genereres ikke via eksogene kerner, men ved anvendelse af ultralydsimpulser med tilstrækkelig spænding til at aktivere kerner iboende væv, herunder blodprop17,18. Den mekaniske svingning af bobleskyen giver stammen til blodproppen og opløser strukturen i acellulære snavs19. Histotripsi boble aktivitet giver effektiv nedbrydning af tilbagetrukne og unretracted blodpropper både in vivo og in vitro20,21,22. Tidligere undersøgelser har23,24 påvist, at kombinationen af histotripsi og lytic rekombinant vævstype plasminogen aktivator (rt-PA) øger behandlingseffektiviteten (rt-PA) betydeligt i forhold til lytic alene eller histotripsi alene. Det er en hypotese, at to primære mekanismer forbundet med histotripsi boble aktivitet er ansvarlige for den forbedrede behandling effekt: 1) øget fibrinolyse på grund af øget lytic levering, og 2) hæmolyse af røde blodlegemer i blodproppen. Hovedparten af blodproppen består af røde blodlegemer24, og derfor er sporing af erythrocyt nedbrydning en god surrogat for ablation af prøven. Andre dannede blodprop elementer er også sandsynligvis opløst under histotripsi boble aktivitet, men er ikke taget i betragtning i denne protokol.
Her er en bordplade tilgang til behandling af DVT in vitro med lysotripsi skitseret. Protokollen beskriver kritiske driftsparametre for histotripsikilden, vurdering af behandlingseffekt og billedvejledning. Protokollen omfatter designe en flow kanal til at efterligne en iliofemoral venøs segment og fremstilling af humane fuldblodspropper. Den eksperimentelle procedure skitserer placeringen af histotripsi kilde og billeddannelse array for at opnå histotripsi eksponering langs blodproppen placeret i flowkanalen. Relevante insonationsparametre for at opnå blodpropforstyrrelser og minimere off-target bobleaktivitet defineres. Brugen af ultralydsscanning til vejledning og vurdering af bobleaktivitet er illustreret24. Målinger til kvantificering af behandlingseffekten, såsom massetab af blodpropper, D-dimer (fibrinolyse) og hæmoglobin (hæmolyse) er skitseret23,24,25,26,27. Samlet set giver undersøgelsen et effektivt middel til at udføre og vurdere effekten af lysotripsi til behandling af DVT.
Den foreslåede protokol præsenterer en model til at kvantificere behandlingseffekten af lysotripsi. Mens de vigtigste detaljer er blevet drøftet, er der visse kritiske aspekter at overveje for succesen af denne protokol. Den enzymatiske aktivitet af RT-PA har en Arrhenius temperatur afhængighed30. Temperatur er også en medvirkende faktor til lydens hastighed i vand og væv, og temperaturudsving kan forårsage mindre ændringer af fokuszonens geometri. Vandtemperaturen bør således reguleres …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, Grant R01HL13334. Forfatterne vil gerne takke Dr. Kevin Haworth for at hjælpe med Drabkin’s assay og Dr. Viktor Bollen for hans støtte i udformningen af protokollen. Forfatterne er også taknemmelige for Dr. Adam Maxwell for hans vejledning om at designe histotripsy kilde.
Absorbing sheets | Precision acoustics | F28-SMALL-M | 300mm x 300 mm x 10 mm |
Borosilicate Pasteur pippettes | Fisher Scientific | 1367820A | 14.6 cm length, 2 mL capacity |
Centrifuge tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL capacity |
Drabkin's assay | Sigma Aldrich | D5941-6VL | |
Draw syringe | Cole-Parmer | EW-07945-43 | 60 mL capacity |
Filter bags | McMaster-Carr | 5162K111 | Remove particle size upto 1 microns |
Flow channel tubing | McMaster-Carr | 5154K25 | Polyethylene-lined EVA plastic tubing (Outer diameter: 3/8", Inner diameter: 1/4" |
Heating elements | Won Brothers | HT 300 Titanium | Titanium rods placed at the bottom of tank |
Imaging array | Verasonics | L11-5v | 128 element with sensitivity from -55 to -49 dB |
Low gelling agarose | Millipore Sigma | A9414 | |
Model vessel | McMaster-Carr | 5234K98 | 6.6 cm length, 0.6 cm inner diameter, 1 mm thickness |
Nanopure water | Barnstead | Nanopure Diamond | ASTM type I, 18 Mohm-cm resistivity |
Plasma | Vitalant | 4PF000 | Plasma frozen within 24 hours |
Plate reader | Biotek | Synergy Neo HST Plate Reader | For haemoglobin quantification |
Probe cover | Civco | 610-362 | |
Programming platform | MATLAB (the Mathworks, Natick, MA, USA) | ||
Recombinant tissue-type plasminogen activator (rt-PA) | Genentech | Activase | |
Reservoir | Cole-Parmer | EW-07945-43 | 60 mL capacity |
Syringe pump | Cole-Parmer | EW-74900-20 | pump attached to the syringe to draw the flow in the flow channel at a pre-determined fized rate |
Transducer | In-house customized | Eight-element, elliptically-focused transducer (9 cm major axis, 7 cm minor axis and 6 cm focal length), powered by custom designed and built class D amplifier and matching network | |
Ultrasound scaning system | Verasonics | Vantage Research Ultrasound System | |
Water tank | Advanced acrylics | C133 | 14 x 14 x 12, 1/2" |