Beurteilung der Biofilmausbreitung in murinen Wunden

Summary

Hier beschreiben wir ex vivo und in vivo Methoden zur Beurteilung der bakteriellen Ausbreitung aus einer Wundinfektion bei Mäusen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Wirksamkeit topischer antimikrobieller und Anti-Biofilm-Therapien zu testen oder die Ausbreitungskapazität verschiedener Bakterienstämme oder -arten zu bewerten.

Abstract

Biofilmbedingte Infektionen sind an einer Vielzahl chronischer Erkrankungen wie nicht heilenden diabetischen Fußgeschwüren, chronischer Sinusitis, wiederkehrender Mittelohrentzündung und vielem mehr beteiligt. Mikrobielle Zellen innerhalb dieser Infektionen werden durch eine extrazelluläre polymere Substanz (EPS) geschützt, die verhindern kann, dass Antibiotika und Wirtsimmunzellen die Infektion beseitigen. Um dieses Hindernis zu überwinden, haben die Forscher begonnen, Dispersionsmittel als potenzielle Therapeutika zu entwickeln. Diese Wirkstoffe zielen auf verschiedene Komponenten innerhalb des Biofilms EPS ab, schwächen die Struktur und initiieren die Ausbreitung der Bakterien, was theoretisch die Antibiotikapotenz und die Immunclearance verbessern kann. Um die Wirksamkeit von Dispersionsmitteln bei Wundinfektionen zu bestimmen, haben wir Protokolle entwickelt, die die Ausbreitung von Biofilmen sowohl ex vivo als auch in vivomessen. Wir verwenden ein chirurgisches Exzisionsmodell der Maus, das gut beschrieben wurde, um biofilm-assoziierte chronische Wundinfektionen zu erzeugen. Um die Ausbreitung in vivo zuüberwachen, infizieren wir die Wunden mit Bakterienstämmen, die Luciferase exprimieren. Sobald sich reife Infektionen etabliert haben, bewässern wir die Wunden mit einer Lösung, die Enzyme enthält, die Bestandteile des Biofilms EPS abbauen. Anschließend überwachen wir die Lage und Intensität des Leuchtsignals in den Wund- und Filterorganen, um Informationen über den erreichten Ausbreitungsgrad zu erhalten. Für die Ex-vivo-Analyse der Biofilmausbreitung wird infiziertes Wundgewebe in biofilmabbauende Enzymlösung getaummt, wonach die im Gewebe verbleibende Bakterienlast im Vergleich zur Bakterienlast in Lösung bewertet wird. Beide Protokolle haben Stärken und Schwächen und können optimiert werden, um die Wirksamkeit von Ausbreitungsbehandlungen genau zu bestimmen.

Introduction

Der Anstieg der Antibiotikaresistenz weltweit führt zu einem Mangel an Antibiotika-Optionen zur Behandlung einer Vielzahl von bakteriellen Infektionen¹. Zusätzlich zur Antibiotikaresistenz können Bakterien eine Antibiotikatoleranz erlangen, indem sie einen Biofilm-assoziierten Lebensstil^{annehmen 2}. Ein Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die durch eine Matrix aus Polysacchariden, extrazellulärer DNA, Lipiden und Proteinen³geschützt sind, die zusammen als extrazelluläre polymere Substanz (EPS) bezeichnet werden. Da die Antibiotikaresistenzkrise andauert, werden neue Strategien, die den Einsatz von Antibiotika verlängern oder die Wirksamkeit von Antibiotika potenzieren, dringend benötigt. Anti-Biofilm-Wirkstoffe sind eine vielversprechende Lösung⁴.

Unter den verschiedenen Anti-Biofilm-Strategien, die vorgeschlagen wurden, steht die Verwendung von Dispersionsmitteln, die auf verschiedene Komponenten des Biofilm-EPS abzielen, an der Spitze der therapeutischen Entwicklung⁵. Glykosidhydrolasen (GH) sind eine solche Klasse von Dispersionsmitteln. GH sind eine große Klasse von Enzymen, die die Spaltung verschiedener Bindungen innerhalb der Polysaccharide katalysieren, die dem EPS strukturelle Integrität verleihen. Unsere Gruppe und andere haben gezeigt, dass GH Biofilme effektiv abbauen, Ausbreitung induzieren und die Antibiotikawirksamkeit für eine Reihe verschiedener Bakterienarten verbessern kann, sowohl in vitro als auch in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Mit einem wachsenden Interesse an der Ausbreitung von Biofilmen ist es wichtig, wirksame Methoden zu entwickeln, die die Ausbreitungseffizienz bewerten. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zur Behandlung von Biofilm-assoziierten Wundinfektionen mit einem Ausbreitungsmittel bei Mäusen und die Beurteilung der Ausbreitungswirksamkeit, in vivo und ex vivo. Das übergeordnete Ziel ist es, effektive Methoden bereitzustellen, die mit präklinischen Modellen verwendet werden können, um die Biofilmausbreitung effektiv und effizient zu messen.

Ein murines chirurgisches Exzisionsinfektionsmodell wurde in diesen Studien verwendet, um eine Biofilm-assoziierte Infektion zu etablieren. Wir verwenden dieses Modell seit über 15 Jahren und veröffentlichen unsere Beobachtungen ausführlich^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Im Allgemeinen ist dies ein nicht-tödliches Infektionsmodell, bei dem Bakterien im Wundbett lokalisiert bleiben und biofilm-assoziiert sind (Bakterien in Aggregaten, die von EPS umgeben sind), was zu einer chronischen Infektion führt, die bis zu 3 Wochen dauert. Wenn Mäuse jedoch immungeschwächt sind (z. B. mit Typ-1-Diabetes), können sie in diesem Modell anfälliger für die Entwicklung einer tödlichen systemischen Infektion werden.

In diesem Bericht stellen wir Protokolle zur Beurteilung der Ausbreitung von Bakterien aus einer Wunde sowohl in vivo als auch ex vivo zur Verfügung. Beide Protokolle können verwendet werden, um die Wirksamkeit eines Dispersionsmittels zu untersuchen und haben ihre eigenen Stärken und Schwächen. Zum Beispiel kann die Beurteilung der Ausbreitung in vivo wichtige Echtzeitinformationen über die Ausbreitung von Bakterien auf andere Teile des Körpers nach der Ausbreitung liefern und wie der Wirt reagiert. Auf der anderen Seite kann die Beurteilung der Ausbreitung ex vivo für das Screening mehrerer Wirkstoffe, Dosen oder Formulierungen wünschenswerter sein, da das Gewebe in mehrere Abschnitte unterteilt werden kann, die separat getestet werden können, wodurch die Anzahl der benötigten Mäuse reduziert wird. Bei der Beurteilung mehrerer Wirkstoffe messen wir typischerweise die Ausbreitung zuerst in vitro, wie zuvor beschrieben ^6,9,22. Wir testen dann die effektivsten ex vivo und reservieren in vivo Tests für eine begrenzte Anzahl von sehr vielversprechenden Wirkstoffen.

Protocol

Dieses Tierprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee des Texas Tech University Health Sciences Center (Protokollnummer 07044) überprüft und genehmigt. Diese Studie wurde in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health durchgeführt. 1. Bakterien auf Mausinfektionen vorbereiten HINWEIS: Hier beschreiben wir die Infektion von Mäusen nur mit Pseu…

Representative Results

In diesem Experiment wurden 8-10 Wochen alte weibliche Schweizer Webster-Mäuse mit 104 KBE PAO1 infiziert, die das Lumineszenzplasmid pQF50-lux trugen. Wie oben beschrieben, durfte eine Infektion für 48 h etabliert werden, bevor 3 x 30 Minuten Behandlungen von entweder PBS (Fahrzeugkontrolle) oder 10% GH (Behandlung) verabreicht wurden, um das Biofilm-EPS zu verdauen. Mäuse wurden vor der Behandlung, direkt nach der Behandlung (0 h) und nach 10 h und 20 h nach der Behandlung abgebildet. <strong class="xfig"…

Discussion

Hier beschreiben wir Protokolle, mit denen die Wirksamkeit von Biofilm-Dispersionsmitteln untersucht werden kann. Diese Protokolle können leicht an die Verwendung mit verschiedenen Arten von Ausbreitungsmitteln, Bakterienarten oder Ex-vivo-Proben, einschließlich klinischer Debridementproben, angepasst werden. Dieses Protokoll bietet auch ein klinisch relevantes Modell zur Sammlung und Untersuchung verteilter Bakterienzellen. Es wurde gezeigt, dass sich die Phänotypen verteilter Bakterienzellen von denen der p…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment