Vurderer biofilmspredning i murine sår

Summary

Her beskriver vi ex vivo og in vivo metoder for å vurdere bakteriell spredning fra en sårinfeksjon hos mus. Denne protokollen kan brukes til å teste effekten av aktuelle antimikrobielle og antibiofilmbehandlinger, eller for å vurdere spredningskapasiteten til forskjellige bakteriestammer eller arter.

Abstract

Biofilmrelaterte infeksjoner er involvert i et bredt spekter av kroniske tilstander som ikke-helbredende diabetiske fotsår, kronisk bihulebetennelse, tilbakevendende otitis media og mange flere. Mikrobielle celler i disse infeksjonene er beskyttet av et ekstracellulært polymerstoff (EPS), som kan forhindre antibiotika og være vert for immunceller fra å fjerne infeksjonen. For å overvinne dette hinderet har etterforskere begynt å utvikle spredningsmidler som potensielle terapeutiske midler. Disse midlene retter seg mot ulike komponenter i biofilm-EPS, svekker strukturen og initierer spredning av bakteriene, noe som teoretisk kan forbedre antibiotikastyrken og immunclearance. For å bestemme effekten av dispergeringsmidler for sårinfeksjoner, har vi utviklet protokoller som måler biofilm dispergering både ex vivo og in vivo. Vi bruker en musekirurgisk eksisjonsmodell som er godt beskrevet for å skape biofilmrelaterte kroniske sårinfeksjoner. For å overvåke sprednings in vivo, smitter vi sårene med bakteriestammer som uttrykker luciferase. Når modne infeksjoner har etablert seg, irrigerer vi sårene med en løsning som inneholder enzymer som forringer komponenter i biofilm EPS. Vi overvåker deretter plasseringen og intensiteten av lystetthetssignalet i sår- og filtreringsorganene for å gi informasjon om nivået av spredning oppnådd. For ex vivo-analyse av biofilmspredning er infisert sårvev nedsenket i biofilmnedbrytende enzymoppløsning, hvorpå bakteriebelastningen som gjenstår i vevet, kontra bakteriebelastningen i løsningen, vurderes. Begge protokollene har styrker og svakheter og kan optimaliseres for å bidra til å nøyaktig bestemme effekten av spredningsbehandlinger.

Introduction

Fremveksten av antibiotikaresistens over hele verden fører til mangel på antibiotikaalternativer for å behandle en rekke bakterielle infeksjoner¹. I tillegg til antibiotikaresistens kan bakterier få antibiotikatoleranse ved å vedta en biofilm-assosiert livsstil². En biofilm er et fellesskap av mikroorganismer som er beskyttet av en matrise av polysakkarider, ekstracellulært DNA, lipider og proteiner³, samlet kalt det ekstracellulære polymere stoffet (EPS). Etter hvert som antibiotikaresistenskrisen fortsetter, er det sårt behov for nye strategier som forlenger bruken av, eller forsterker effekten av antibiotika. Antibiofilmmidler er en lovende løsning⁴.

Blant de forskjellige antibiofilmstrategiene som er foreslått, er bruken av dispergeringsmidler, som retter seg mot forskjellige komponenter i biofilm-EPS, i forkant av terapeutisk utvikling⁵. Glykosidhydrolaser (GH) er en slik klasse av dispergeringsmiddel. GH er en stor klasse enzymer som katalyserer spaltingen av forskjellige bindinger i polysakkaridene som gir strukturell integritet til EPS. Vår gruppe, så vel som andre, har vist at GH effektivt kan forringe biofilmer, indusere spredning og forbedre antibiotikaeffekten for en rekke forskjellige bakteriearter, både in vitro og in vivo^{6,7,8,9,10,11}.

Med en økende interesse for biofilmspredning er det viktig å utvikle effektive metoder som vurderer spredningseffekt. Her presenterer vi en detaljert protokoll for behandling av biofilm-assosierte sårinfeksjoner med et dispergeringsmiddel hos mus, og vurdering av spredningseffekt, in vivo og ex vivo. Det overordnede målet er å gi effektive metoder som kan brukes med prekliniske modeller for å måle biofilmspredning effektivt og effektivt.

En murin kirurgisk eksisjonsinfeksjonsmodell ble brukt i disse studiene for å etablere en biofilm-assosiert infeksjon. Vi har brukt denne modellen i over 15 år og publisert våre observasjoner mye^{7,9,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21}. Generelt er dette en ikke-dødelig infeksjonsmodell der bakterier forblir lokalisert til sårsengen og er biofilmrelaterte (bakterier sett i aggregater omgitt av EPS), og setter opp en kronisk infeksjon som varer opptil 3 uker. Men hvis mus er immunkompromittert (med type 1 diabetes for eksempel), kan de bli mer utsatt for å utvikle en dødelig systemisk infeksjon i denne modellen.

I denne rapporten gir vi protokoller for å vurdere spredning av bakterier fra et sår, både in vivo og ex vivo. Begge protokollene kan brukes til å undersøke effekten av et dispergeringsmiddel og ha sine egne styrker og svakheter. For eksempel kan vurdering av dispergering in vivo gi viktig sanntidsinformasjon om spredning av bakterier til andre deler av kroppen etter spredning, og hvordan verten reagerer. På den annen side kan det være mer ønskelig å vurdere spredning ex vivo for screening av flere midler, doser eller formuleringer, da vevet kan deles inn i flere seksjoner som kan testes separat, og dermed redusere antall mus som kreves. Når vi vurderer flere agenter, måler vi vanligvis spredning første in vitro som tidligere beskrevet ^6,9,22. Vi tester deretter den mest effektive ex vivo og reserverer in vivo-testing for et begrenset antall svært lovende midler.

Protocol

Denne dyreprotokollen ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center (protokollnummer 07044). Denne studien ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. 1. Forbereder bakterier for museinfeksjoner MERK: Her beskriver vi smittende mus bare med Pseudomonas aeruginosa. Imidlertid kan andre bakteriearter bru…

Representative Results

I dette eksperimentet ble 8-10 uker gamle kvinnelige sveitsiske Webster-mus smittet med 104 CFU av PAO1 som bærer luminescensplasmid pQF50-lux. Som beskrevet ovenfor fikk en infeksjon lov til å etablere i 48 timer før administrering av 3 x 30 min behandlinger av enten PBS (kjøretøykontroll) eller 10% GH (behandling) for å fordøye biofilm EPS. Mus ble avbildet forbehandling, rett etter behandling (0 h) og ved 10 timer og 20 timer etter behandling. Figur 2A og suppler…

Discussion

Her beskriver vi protokoller som kan brukes til å studere effekten av biofilmdispergeringsmidler. Disse protokollene kan enkelt tilpasses for bruk med ulike typer dispergeringsmidler, bakteriearter eller ex vivo-prøver, inkludert kliniske debrideringsprøver. Denne protokollen gir også en klinisk relevant modell for å samle og studere dispergerte bakterieceller. Fenotypene av dispergerte bakterieceller har vist seg å være forskjellige fra de av enten planktoniske eller biofilmceller ^5</su…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Fisher	14823434	Use to complete serial dilutions of samples
25G 58 in needle	Fisher	14823434	Attaches to 1 mL syringe
Ampicillin Sodium Salt	Fisher	BP1760-5	Make a 50 mg/ mL stock solution and add 100 µL to 10 mL of LB broth for both overnight and subculture
Amylase	MP Biomedicals	2100447	Make a 5% w/v solution, vortex- other dispersal agents can be used
Buprenorphine SR-LAB 5 mL (1 mg/mL)	ZooPharm	RX216118	Use as pain mainagement- may use other options
Cellulase	MP Biomedicals	2150583	Add 5% w/v to the 5% w/v amylase solution, vortex, activate at 37 °C for 30 min- other dispersal agents can be used
Depilatory cream	Walmart	287746	Use a small amount to massage into the hair follicles on the back of the animal and allot 10 min to remove hair
Dressing Forceps, Serrated Tips	Fisher	12-460-536	Can use other forms of forceps
Erlenmeyer flasks baffled 125 mL	Fisher	101406	Use to grow overnights and sub-cultures of bacteria
FastPrep-24 Benchtop Homogenizer	MP Biomedicals	6VFV9	Use 5 m/s for 60 s two times to homogenize tissue
Fatal Plus	Vortech Pharmaceuticals	0298-9373-68	Inject 0.2 mL intraperitaneal for each mouse
Homogenizing tubes (Bead Tube 2 mL 2.4 mm Metal)	Fisher	15340151	Used to homogenize samples for plating
Isoflurane	Diamond Back Drugs
Ketamine hydrochloride/xylazine hydrochloride solution C-IIIN	Sigma Aldrich	K4138	Use as anasethia- other options can also be utilized to gain a surgical field of anasethia
LB broth, Miller	Fisher	BP1426-2	Add 25 g/L and autoclave
Lidocaine 2% Injectable	Diamond Back Drugs	2468	Inject 0.05 mL through the side of the marked wound bed area so it is deposited in the center of the mark. Allot 10 min prior to cutting
Meropenem	Sigma Aldrich	PHR1772-500MG	Make 5 mg/mL to add to the GH solution to apply topically and a 15 mg/mL solution to inject intraperitaneal 4 h prior and 6 h post-treatment
Non-sterile cotton gauze sponges	Fisher	13-761-52	Use to remove the depilatory cream
PAO1 pQF50-lux bacterial strain	Ref [13]	N/A	PAO1 pgF50-lux was used as the P. aeruginosa strain of interest in this paper's representative results
Petri dishes	Fisher	PHR1772-500MG
Phosphate Buffer Saline 10x	Fisher	BP3991	Dilute 10x to 1x prior to use
Polyurethane dressing	Mckesson	66024007	Cut the rounded edge off and cut the remaining square into 4 equal sections
Pseudomonas isolation agar	VWR	90004-394	Add 20 mL/L of glycerol and 45 g/mL to water, autoclave, and pour 20 mL into petri dishes
Refresh P.M.	Walmart		Use on eyes to reduce dryness during procedure.
Sterile Alcohol Prep Pads	Fisher	22-363-750	Use to clean the skin immediately prior to wounding to disinfect the area
Straight Delicate Scissors	Fisher	89515	Can also use curved scissors
Swiss Webster mice	Charles River	551NCISWWEB	Other mice strains can be used
Syring Slip Tip 1 mL	Fisher	14823434	Used to administer drugs and enzyme treatment