3D-avbildning av PDL kollagenfibrer under tandreglering av tanddont i mandibular murinmodell

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att generera tandreglering tand rörlighet hos möss och metoder för 3D visualisering av kollagen fibrer och blodkärl av parodontala ligament utan sektionering.

Abstract

Tandreglering tandrörelse är en komplex biologisk process av förändrad mjuk och hård vävnadsrenovering som ett resultat av yttre krafter. För att förstå dessa komplexa ombyggnadsprocesser är det viktigt att studera tand- och parodontala vävnader i deras 3D-sammanhang och därför minimera eventuella sektionerings- och vävnadsföremål. Musmodeller används ofta i utvecklings- och strukturbiologi, liksom i biomekanik på grund av deras lilla storlek, höga ämnesomsättning, genetik och enkel hantering. I princip gör detta dem också utmärkta modeller för tandrelaterade studier. Ett stort hinder är dock deras lilla tandstorlek, molarerna i synnerhet. Detta papper syftar till att tillhandahålla ett steg för steg protokoll för att generera tandreglering tandrörelse och två metoder för 3D imaging av parodontala ligament fibrös komponenten i en mus mandibular molar. Den första metoden som presenteras är baserad på en mikro-CT-installation som möjliggör fasförstoring av färska kollagenvävnader. Den andra metoden är en benrensningsmetod med etylcinnamat som möjliggör avbildning genom benet utan att dela upp och bevarar endogen fluorescens. Kombinera denna clearingmetod med reportermöss som Flk1–Cre; TdTomato gav en första av sitt slag möjlighet att avbilda 3D vaskulaturen i PDL och alveolar ben.

Introduction

Den grundläggande underliggande biologiska processen i tandreglering tand rörelse (OTM) är ben ombyggnad. Utlösaren för denna ombyggnadsprocess tillskrivs förändringar i strukturen hos parodontala ligament (PDL) såsom extracellulär matris (ECM) stress, nekros samt blodkärl förstörelse och bildandet^1,2,3. Andra möjliga utlösare för alveolär benombyggnad är relaterade till kraftavkänning av osteocyter i benet, liksom mekanisk deformation av själva alveolära benet; men deras roll i OTM är fortfarande inte helt klarlagd^4,5.

Trots många studier som syftar till att avslöja struktur-funktion relationer av PDL under OTM, en tydlig funktionell mekanism är ännu inte definierad^6,7. Den främsta orsaken till detta är utmaningen att hämta data från en mjukvävnad (PDL) som ligger mellan två hårda vävnader (cementum och alveolar ben). De accepterade metoderna för att samla in strukturell information kräver vanligtvis fixering och sektionering som stör och ändrar PDL-strukturen. Dessutom ger de flesta av dessa metoder 2D-data som även om de inte förvrängs, bara ger partiell och lokaliserad information. Eftersom PDL inte är enhetlig i sin struktur och funktion, är ett tillvägagångssätt som adresserar den intakta 3D-strukturen hos hela tand-PDL-benkomplexet motiverat.

Detta papper kommer att beskriva en metod för att generera en OTM hos möss och två metoder som möjliggör 3D-visualisering av kollagenfibrerna i PDL utan någon sektionering av provet.

Murinmodeller används ofta för in vivo-experiment inom medicin, utvecklingsbiologi, läkemedelsleverans och strukturella studier. De kan modifieras genetiskt för att eliminera eller förbättra specifika proteiner och funktion. De ger snabb, repeterbar och förutsägbar utvecklingsstyrning. de är också lätta att avbilda på grund av deras lilla storlek⁸. Trots sina många fördelar används musmodeller i tandforskning inte ofta, särskilt när kliniska manipuleringar är motiverade, främst på grund av de små tänderna. Djurmodeller som råttor^9,10,11,hundar^12,13,grisar^14,15,16 och^{apor 17} används oftare än möss. Med den senaste utvecklingen av högupplösta bildtekniker är fördelarna med att använda en musmodell för att dechiffrera de invecklade processerna i OTM många. Detta papper presenterar en metod för att generera en mesial rörelse av molar tand i underdible med konstant kraft nivåer som utlöser ben ombyggnad. De flesta AV OTM-experimenten hos gnagare görs i maxillan, eftersom underkäkens rörlighet och närvaron av tungan lägger till en annan komplexitetsnivå. Underdiblen har dock många fördelar när 3D strukturell integritet önskas. Det kan lätt dissekeras som ett helt ben; i vissa arter kan det delas in i två hemi-mandibles genom fibrös symphysis; den är kompakt, platt och innehåller endast tänderna utan sinusutrymmen. Däremot är maxillan en del av skallen och nära besläktade med andra organ och strukturer, vilket innebär att omfattande sektionering behövs för att dissekera det alveolära benet med tillhörande tänder.

Med hjälp av en in house fuktighetskammare i kombination med ett lastningssystem inuti en högupplöst mikro-CT som möjliggör fasförbättring, utvecklade vi en metod för att visualisera färska fibrösa vävnader i 3D som tidigare^{beskrivits 9,18,19,20,21,22,23}. Färska vävnader skannas omedelbart efter att djuret offras utan färgning eller fixering, vilket minskar vävnadsartefakter samt förändringar av biomekaniska egenskaper. Dessa 3D-data kan användas för distributions- och riktningsanalyser av fibrerna enligt beskrivningen på annat håll¹⁹.

Den andra 3D-metoden för helvävnadsavbildning som presenteras här är baserad på optisk rensning av underdiblen som möjliggör avbildning av PDL-fibrerna genom benet utan någon sektionering. Intressant nog möjliggör det också visualisering av själva benets kollagenfibrer, men detta kommer inte att diskuteras här. I allmänhet finns det två metoder för vävnadsrensning. Den första är vattenbaserad röjning där provet är nedsänkt i en vattenlösning med ett brytningsindex som är större än 1,4 antingen genom en enkel nedsänkning, hyperhydrering eller hydrogelinbäddning. Denna metod är dock begränsad i graden av öppenhet samt det strukturella bevarandet av vävnaden och kräver därför fixering av vävnaden. Den andra metoden som ger mycket transparenta prover och inte kräver fixering är den lösningsmedelsbaserade clearingmetoden^24,25. Vi genererade en modifierad lösningsmedelsbaserad clearingmetod baserad på etyl-3-fenylprop-2-enoat (etylcinnamat, ECi) för mandibularproverna. Denna metod har fördelarna med att använda giftfritt livsmedelskvalitets clearingmedel, minimal vävnadskrymp och bevarande av fluorescerande proteiner.

Protocol

Alla djurförsök utfördes i enlighet med NIH:s riktlinjer för vård och användning av laboratoriedjur och riktlinjer från Harvard University Institutional Animal Care and Use Committee (protokoll nr 01840). 1. Tandreglering av ortodontiska För att generera en mussäng, använd en platt plastplattform med ett kilformat, 45° vinklat nackstöd. Nackstödet kan genereras genom att skära en plastlåda. Lyft plattformens huvudände för att generera en cirka 30° vinkel mel…

Representative Results

Detta dokument presenterar en metod för att producera OTM samt två metoder för 3D-avbildning av kollagenfibrer inuti PDL utan någon sektionering. För djurforskningsändamål, när anpassning av tänderna inte är nödvändig, anses en tandrörelse tandreglering tandreglering om den genererar ombyggnad av det alveolära benet på alla rotnivåer. Konstant kraftnivå som appliceras på tänder krävs för att generera en pålitlig OTM. Här används en aktiverad formminne NiTi-spole för att generera en konsekvent kra…

Discussion

Att generera OTM hos möss är mycket önskvärt på grund av storlek, genetik och hanteringsfördelar. Att använda underdiblen ger en enkel hantering både när det gäller vävnadsav dissekering samt provberedning och avbildning. Här presenterade vi en metod för att generera OTM med translationell rörelse av tanden inuti benet inom 7 dagar efter OTM. Med hjälp av detta protokoll kan tandrörelsens totala varaktighet förlängas, eftersom den aktiverade spolen ger en konstant kraftnivå för rörelse på upp till c…

Materials

1-mL BD Luer-Lok syringe	BD	309628
1X phosphate buffered saline	VWR Life Sciences	0780-10L
200 proof ethanol	VWR Life Sciences	V1016
Aluminum alloy 5019 wire	Sigma-aldrich	GF15828813	0.08 mm diameter wire, length 100th, temper hard. Used as wire ligature around molar.
Avizo 9.7	Thermo Fisher Scientific	N/A	Used to analyze microCT scans
Castroviejo Micro Needle Holders	Fine Science Tools	12060-01
Clr Plan-Apochromat 20x/1.0,CorrVIS-IR M27 85mm	Zeiss	N/A	Used for second harmonic generation imaging
Cone socket handle, single ended, hand-form	G.Hartzell and son	126-CSH3	Handle of the inspection mirror
EC Plan-Neofluar 5x/0.16	Zeiss	440321-9902	Used for light-sheet imaging
Elipar DeepCure-S LED curing light	3M ESPE	76985
Eppendorf safe-lock tubes, 1.5mL	Eppendorf	22363204
Ethyl cinnamate, >= 98%	Sigma-aldrich	W243000-1KG-K
Hypodermic Needle, 27G x 1/2''	BD	305109
Ketathesia 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-0702-1
KIMWIPES delicate task wipers	Kimberly-Clark	21905-026 (VWR Catalog number)	Purchased from VWR
LightSheet Z.1 dual illumination microscope system	Zeiss	LightSheet Z.1/LightSheet 7	Used for lightsheet imaging
LSM 880 NLO multi-photon microscope	Zeiss	LSM 880 NLO	Used for two-photon imaging
MEGAmicro, plane, 5mm dia, SS-Thread	Hahnenkratt	6220	Front surface inspectrio mirror
MicroCT machine, MicroXCT-200	Xradia	MICRO XCT-200
Mini-Colibri	Fine Science Tools	17000-01
PermaFlo Flowable Composite	Ultradent	948
Procedure platform	N/A	N/A	Custom-made from lab materials
Routine stereo micscope M80	Leica Micosystems	M80
Sentalloy NiTi open coil spring	TOMY Inc.		A 0.15mm diameter closed NiTi coil with an inner coil diameter of 0.9mm delivers a force of 10g. Similar products can be purchased from Dentsply Sirona.
T-304 stainless steel ligature wire, 0.009'' diameter	Orthodontics	SBLW109	0.009''(.23mm) diameter, Soft temper
X-Ject E (Xylazine) 100mg/ml	Henry Schein Animal Health	NDC:11695-7085-1
Z100 Restorative, A2 shade	3M ESPE	5904A2