该协议的目的是使用活成像来可视化氧化损伤对 果蝇 卵巢中亚细胞结构的定位和动力学的影响。
血友病黑色素卵巢的活成像有助于了解发育过程中的各种基本细胞过程,包括核糖核蛋白粒子运动、mRNA定位、细胞运动和细胞骨骼动力学。已开发出多种实时成像方法。由于每个方法都涉及解剖放置在介质或卤氢油中的单个卵巢,因此随着时间的推移,由于缺氧和/或物理操作而导致的细胞损伤将不可避免地发生。缺氧的一个下游效应是增加细胞的氧化损伤。此协议的目的是使用实时成像来可视化氧化损伤对受控细胞损伤诱导后淋病卵巢中亚细胞结构的定位和动态的影响。在这里,我们使用过氧化氢诱导细胞氧化损伤,并举例说明这种损伤对两个亚细胞结构的影响,线粒体和Clu幸福颗粒。但是,此方法适用于任何子细胞结构。限制是过氧化氢只能添加到水介质中,不能用于使用卤碳油的成像。其优点是过氧化氢是现成的,价格便宜,作用迅速,其浓度可以调节,氧化损伤是缺氧造成的损害以及操作造成的一般组织损伤的良好近似。
在实验培养和组织前体内操作过程中,可能会产生多种不同的细胞应激因素,包括热休克、氧化应激、渗透应激、营养应激和毒性条件。实时成像是一种强大的工具,用于在实验治疗和操作后可视化前体内组织的实时变化。精细组织解剖和操作需要实践,从解剖到成像的时间可能因经验而异。开发这种方法的理由是担心为活体成像准备组织在解剖和成像准备过程中会导致细胞应激。对于对细胞代谢变化和可用氧气水平(如线粒体功能)敏感的过程,这可能特别成问题。虽然有一个平行的野生类型样本是一个重要的控制,仍然有可能部分或全部观察到的细胞下结构的变化可能是由于解剖造成的损伤或细胞应力,并不反映正常的生理或正在研究的治疗或突变。
为了解决这个潜在的问题,我们在实时成像过程中使用过氧化氢添加物来诱导细胞氧化损伤1。这种方法的目的是诱发组织损伤,以监测对细胞下结构的影响。此协议有两个用途:1) 确定兴趣结构的亚细胞定位变化是否是由于缺乏经验的解剖造成的压力,2) 一旦研究人员对所述的解剖技术有信心,以监测受控压力对利益结构的影响。在这里,我们展示了两个例子,说明增加的氧化损伤如何导致两个亚细胞结构的变化,线粒体和Clu幸福颗粒。为此,我们使用嗜血杆菌卵巢,这是现场成像研究的常见模型。第一个例子检查线粒体定位。根据我们的经验,女性生殖细胞中正常的线粒体定位对扰动非常敏感,可以作为细胞应激的预兆。嗜血杆菌中女性生殖细胞中的线粒体通常均匀地分散在整个细胞质2。过氧化氢的添加导致细胞器迅速误位和聚集的方式类似于各种突变3,4,5。第二个例子是由无线索(Clu)形成的幸福粒子。Clu 是一种核糖核蛋白,在整个细胞质中扩散:然而,它也形成线粒体相关的粒子在最佳的细胞条件5。由于Clu粒子的存在取决于健康的细胞条件,我们称它们为”幸福”粒子3,5,6。添加过氧化氢会导致这些颗粒迅速分散,并在细胞质5中变得均匀。在我们的研究过程中,我们观察到这两种亚细胞结构的定位变化,但只有在进行现场成像研究之后,我们才能充分了解细胞应力和氧化损伤对线粒体和幸福粒子的定位和动力学的影响。
本协议作为已建立或替代方法的补充的用途取决于几个因素。首先,成像协议必须适应药物添加。如果样品安装在盖夹下,并安装在光环油中,这种方法将是不可能的7。H2O2 添加会导致氧化损伤迅速增加,因此,此时间尺度可能不合适。氧化损伤可视为缺氧的代名。然而,它可能过于苛刻或过于笼统,无法作为对某些亚细胞组件损坏的适当控制。最后,对于持续数小时的成像实验,例如那些遵循发育过程的成像实验,H2O2 的添加可能太强(例如8)。测试浓度曲线可以克服此限制。
此协议可能是一个有用的补充,作为对由于卵巢解剖和组织孵化任何活成像实验的神器的控制。关键步骤与其他实时成像协议中的步骤类似。学习如何解剖整个 嗜血杆菌 卵巢需要实践:但是,使用适当的解剖工具通常可以相当快地学习此技能。更难掌握的是切除包围卵巢的肌肉和每个卵巢13。必须这样做,以确保肌肉收缩不会干扰图像采集。如果使用锋利的钨针做到这一点并不成功,在卵巢尖端的细菌可以抓住钳子和卵巢从肌肉护套拉。然而,如果要检查最早的发展阶段,这种技术是有问题的,因为它们可能会损坏。另一个关键步骤是不要在添加H2O2时将放在菜底的卵巢移除。另一个重要方面是所有现场成像共享:研究人员应确保在治疗前对兴趣结构进行荧光良好的标记。这里使用的菜肴(材料表)通常用于现场成像:但是,只要可以覆盖介质的掉落以防止介质蒸发,任何底部有玻璃盖片的碟子或滑动,甚至大玻璃盖片都应该有效。当我们使用特定显微镜时,任何具有足够放大目标的倒置显微镜,以查看所涉及的亚细胞结构以及具有足够分辨率和图像捕获速率的附加摄像机,都应有效。
虽然我们的实验室主要对线粒体功能感兴趣,但这种方法可能有助于检查任何亚细胞结构或细胞器的动态和定位,如细胞核、细胞骨骼或内质视网膜。但是,此方法有局限性。为了添加过氧化氢,组织必须在水介质中。活体成像的另一种方法是使用卤碳油,它有助于描述果蝇卵巢中的许多重要过程,包括GFP在模型生物体7,14中的动态运动的第一个例子。此外,在介质中添加过氧化氢会导致广泛传播的氧化损伤,这可能过于普遍,对组织造成侮辱,无法为感兴趣的细胞过程提供信息,尤其是对于研究发育的较长实验而言。虽然由于这种快速、广泛和可能不可逆转的氧化损伤,进行需要长时间可视化细胞的实验可能不可行,但我们已经看到,我们描述的急性过氧化氢处理适用于卵母细胞生成的大多数阶段,因为我们能够在成像期间的大多数阶段看到相同的效果。鉴于协议成本低且易于使用,它可能是一种有用的损伤控制方法,在固定和抗体标记之前也可用作治疗。
在我们手中,H2O2 治疗模仿线粒体错位和 Clu 幸福粒子分散的变化,我们在各种 嗜血杆菌 突变体中看到。它还模仿了我们在实验室中学习解剖技术的新研究人员发现的结果。因此,这种方法清楚地表明,样品制备和一般细胞应力可导致线粒体错位和幸福颗粒的存在的意外和以前无法解释的变化。将这项技术向前推进,过氧化氢浓度可以使用更高或更低的浓度进行调节。如果使用较低的浓度来观察细胞效应,则通过将介质替换为”完全施耐德”,则压力表型可能是可逆的。不同的细胞应激剂,如氰化物m-叶绿素氢化物(CCCP)、砷酸盐或简单的热冲击,可能证明对其他细胞下结构的一般细胞应力有用。由于前体内组织的活体成像需要在不同的介质中手动操作和孵化,因此这种控制应该是一个有用的补充,以确保任何观测结果尽可能接近正常生理学。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢杰里米·斯密斯博士的成像支持和安·申克的插图,制作和摄像。这项工作得到了国家卫生研究院(1R01GM127938至R.T.C)的支持。
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |