Das Ziel dieses Protokolls ist es, live Bildgebung zu verwenden, um die Auswirkungen von oxidativen Schäden auf die Lokalisierung und Dynamik subzellulärer Strukturen in Drosophila-Ovarien zu visualisieren.
Die Live-Bildgebung von Drosophila melanogaster Eierstöcken war entscheidend für das Verständnis einer Vielzahl grundlegender zellulärer Prozesse während der Entwicklung, einschließlich Ribonukleoprotein-Partikelbewegung, mRNA-Lokalisierung, Organelle-Bewegung und Zytoskelettdynamik. Es gibt mehrere Methoden für Live-Bildgebung, die entwickelt wurden. Aufgrund der Tatsache, dass jede Methode beinhaltet die Sezieren einzelner Eizellen in Medien oder Halocarbonöl platziert, Zellschäden durch Hypoxie und / oder physikalische Manipulation wird unweigerlich im Laufe der Zeit auftreten. Eine nachgelagerte Wirkung von Hypoxie ist die Erhöhung der oxidativen Schäden in den Zellen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, Live-Bildgebung zu verwenden, um die Auswirkungen von oxidativen Schäden auf die Lokalisierung und Dynamik von subzellulären Strukturen in Drosophila Eierstöcke naden nach der Induktion von kontrollierten Zellschäden zu visualisieren. Hier verwenden wir Wasserstoffperoxid, um zelluläre oxidative Schäden zu induzieren und geben Beispiele für die Auswirkungen solcher Schäden auf zwei subzelluläre Strukturen, Mitochondrien und Clu-Glückseligkeitspartikel. Diese Methode ist jedoch auf jede subzelluläre Struktur anwendbar. Die Einschränkungen sind, dass Wasserstoffperoxid nur wässrigen Medien zugesetzt werden kann und nicht für die Bildgebung funktionieren würde, die Halocarbonöl verwendet. Die Vorteile sind, dass Wasserstoffperoxid leicht verfügbar und kostengünstig ist, schnell wirkt, seine Konzentrationen moduliert werden können, und oxidative Schäden ist eine gute Annäherung an Schäden durch Hypoxie sowie allgemeine Gewebeschäden durch Manipulation.
Mehrere verschiedene zelluläre Stressoren können während der experimentellen Kultur und Manipulation von Geweben ex vivo entstehen, einschließlich Hitzeschock, oxidativer Stress, osmotischer Stress, Ernährungsstress, und Toxizität Bedingungen. Live Imaging ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das verwendet wird, um Echtzeit-Änderungen in Ex-vivo-Geweben nach experimenteller Behandlung und Manipulation zu visualisieren. Feine Gewebesektionen und Manipulationen nehmen Praxis in Anspruch, und die Zeit von der Zerlegung bis zur Bildgebung kann je nach Erfahrung variieren. Die Begründung für die Entwicklung dieser Methode basiert auf der Sorge, dass die Vorbereitung von Gewebe für die Live-Bildgebung zellulären Stress während der Zerlegung und bildgebenden Vorbereitung verursachen kann. Dies könnte besonders problematisch für Prozesse sein, die empfindlich auf Veränderungen des Zellstoffwechsels und verfügbare Sauerstoffwerte reagieren, wie z. B. die mitochondriale Funktion. Obwohl eine parallele Wildtypprobe eine wichtige Kontrolle ist, besteht immer noch die Möglichkeit, dass einige oder alle beobachteten Veränderungen in subzellulären Strukturen auf Schäden oder Zellstress durch Zerlegung zurückzuführen sein könnten und nicht die normale Physiologie oder die untersuchte Behandlung oder Mutation widerspiegeln.
Um dieses potenzielle Problem anzugehen, verwenden wir die Wasserstoffperoxidzugabe während der Live-Bildgebung, um zelluläre oxidative Schäden zu induzieren1. Der Zweck dieser Methode ist es, Schäden an Geweben zu induzieren, um die Auswirkungen auf subzelluläre Strukturen zu überwachen. Dieses Protokoll ist für zwei Zwecke nützlich: 1) die Bestimmung, ob Veränderungen in der subzellulären Lokalisierung der Struktur von Interesse auf die Belastung durch unerfahrene Sezieren verursacht und 2) sobald der Forscher mit den beschriebenen Seziertechniken vertraut ist, um die Auswirkungen der kontrollierten Spannung auf die Struktur des Interesses zu überwachen. Hier zeigen wir zwei Beispiele, wie erhöhte oxidative Schäden Veränderungen in zwei subzellulären Strukturen verursachen, Mitochondrien und Clu-Glückseligkeitspartikel. Um dies zu tun, verwenden wir die Drosophila Eierstock, die ein gemeinsames Modell für Live-Bildgebung Studien ist. Das erste Beispiel untersucht die mitochondriale Lokalisierung. Nach unserer Erfahrung ist die normale mitochondriale Lokalisation in weiblichen Keimzellen hochempfindlich gegenüber Störungen und kann als Vorbote zellulärer Stress wirken. Mitochondrien in Drosophila weiblichen Keimzellen sind normalerweise gleichmäßig über das Zytoplasmaverteilt 2. Die Wasserstoffperoxidaddition bewirkt, dass die Organellen schnell falsch lokalisiert und sich in ähnlicher Weise wie verschiedene Mutationen3,4,5. Das zweite Beispiel sind Glückspartikel, die von Clueless (Clu) gebildet werden. Clu ist ein Ribonukleoprotein, das im gesamten Zytoplasma diffus ist; es bildet aber auch Mitochondrien-assoziierte Teilchen unter optimalen zellulären Bedingungen5. Da das Vorhandensein von Clu-Partikeln von gesunden zellulären Bedingungen abhängt, haben wir sie als “Glückseligkeit” Partikel3,5,6bezeichnet. Die Zugabe von Wasserstoffperoxid bewirkt, dass sich diese Partikel schnell dispergieren und im Zytoplasma homogen werden5. Im Laufe unserer Studien haben wir Veränderungen in der Lokalisation dieser beiden subzellulären Strukturen beobachtet, aber erst nach der Durchführung von Live-Bildgebungsstudien konnten wir die Wirkung von zellulärem Stress und oxidativen Schäden auf die Lokalisation und Dynamik von Mitochondrien und Glückspartikeln vollständig erkennen.
Der Nutzen dieses Protokolls als Ergänzung zu bereits etablierten oder alternativen Methoden hängt von mehreren Faktoren ab. Erstens muss das Bildgebungsprotokoll für die Arzneimittelzugabe zugänglich sein. Wenn die Probe unter einem Deckschein und in Halocarbonöl montiert wird, wäre diese Methode nicht möglich7. H2O2 Zusatz verursacht einen schnellen Anstieg der oxidativen Schäden, daher kann diese Zeitskala nicht angemessen sein. Oxidative Schäden können als Proxy für Hypoxie angesehen werden; Es kann jedoch zu hart oder zu verallgemeinert sein, um als geeignete Kontrolle für Schäden für bestimmte subzelluläre Komponenten zu funktionieren. Schließlich kann für bildgebende Experimente, die Stunden dauern, wie sie nach einem Entwicklungsprozess dauern, dieH2O2-Zugabe zu stark sein (z. B.8). Das Testen einer Konzentrationskurve kann diese Einschränkung überwinden.
Dieses Protokoll könnte eine nützliche Ergänzung als Kontrolle für Artefakte aufgrund der Eierstocksektion und Gewebeinkubation für jedes Live-Bildgebungsexperiment sein. Die kritischen Schritte ähneln denen anderer Live-Imaging-Protokolle. Zu lernen, wie man ganze Drosophila Eierstöcke seziert, braucht Praxis; Diese Fertigkeit kann jedoch in der Regel relativ schnell mit den entsprechenden Sezierwerkzeugen erlernt werden. Schwieriger zu meistern ist das Entfernen des Muskels, der die Eierstöcke und jedes Ovariole13umhüllt. Dies muss getan werden, um sicherzustellen, dass Muskelkontraktionen nicht mit der Bildaufnahme stören. Wenn die Verwendung von geschärften Wolframnadeln, um dies zu tun, nicht erfolgreich ist, kann das Germarium an der Spitze des Ovariole mit Zangen und die Ovariole aus der Muskelscheide gezogen werden. Diese Technik ist jedoch problematisch, wenn die frühesten Entwicklungsstadien untersucht werden sollen, da sie beschädigt werden können. Ein weiterer wichtiger Schritt ist es, die Ovariolen, die auf der Unterseite der Schale ruhen, beim Hinzufügen von H2O2nicht zu vertreiben. Ein weiterer wichtiger Aspekt wird von allen Live-Bildgebung geteilt: Der Forscher sollte sicherstellen, dass die Struktur von Interesse fluoreszierend gut markiert wird, bevor die Behandlung. Die hier verwendeten Gerichte (Tabelle der Materialien) werden häufig für Live-Bildgebung verwendet; Jedoch sollte jede Schale oder Rutsche mit einem Glasdeckel auf der Unterseite oder sogar einem großen Glasabdeckungsslip funktionieren, solange der Tropfen der Medien abgedeckt werden kann, um eine Verdunstung der Medien zu verhindern. Während wir ein bestimmtes Mikroskop verwenden, sollte jedes invertierte Mikroskop mit dem Ziel einer ausreichenden Vergrößerung, um die betreffende subzelluläre Struktur zu sehen, und eine angeschlossene Kamera mit ausreichender Auflösung und Bildaufnahmerate funktionieren.
Während unser Labor in erster Linie an mitochondrialer Funktion interessiert ist, könnte diese Methode hilfreich sein, die Dynamik und Lokalisierung jeder subzellulären Struktur oder Organelle, wie z. B. des Kerns, des Zytoskeletts oder des endoplasmatischen Retikulums, zu untersuchen. Diese Methode hat jedoch Einschränkungen. Um Wasserstoffperoxid hinzuzufügen, muss sich das Gewebe in einem wässrigen Medium begeben. Eine alternative Methode für die Live-Bildgebung ist die Verwendung von Halocarbonöl, das bei der Beschreibung vieler wichtiger Prozesse in Drosophila-Ovariolen, einschließlich des ersten Beispiels der dynamischen Bewegung von GFP in einem Modellorganismus,7,14,eine wichtige Rolle spielt. Darüber hinaus verursacht die Zugabe von Wasserstoffperoxid in die Medien eine weit verbreitete oxidative Schädigung, die eine zu allgemeine Beleidigung des Gewebes sein kann, um für den zellulären Prozess von Interesse informativ zu sein, insbesondere für längere Experimente, die die Entwicklung untersuchen. Obwohl es möglicherweise nicht möglich ist, Experimente durchzuführen, die aufgrund dieser schnellen, umfangreichen und wahrscheinlich irreversiblen oxidativen Schäden die Zelle über einen längeren Zeitraum visualisieren müssen, haben wir gesehen, dass die von uns beschriebene akute Wasserstoffperoxidbehandlung auf die meisten Stadien der Oogenese anwendbar ist, da wir in der Lage sind, die gleichen Effekte in den meisten Stadien innerhalb des Bildgebungszeitraums zu sehen. Angesichts der geringen Kosten und der Leichtigkeit des Protokolls kann es eine nützliche Kontrolle für Schäden sein und kann auch als Behandlung vor fixierender und Antikörperkennzeichnung verwendet werden.
In unseren Händen imitiert die H2O2-Behandlung die Veränderungen der mitochondrialen Fehllokalisierung und der Clu-Glückseligkeitspartikeldispersion, die wir in verschiedenen Drosophila-Mutanten sehen. Es imitiert auch Ergebnisse, die wir für neue Forscher im Labor lernen Seziertechniken sehen. Daher zeigte diese Methode deutlich, dass Probenvorbereitung und allgemeiner zellulärer Stress zu unerwarteten und zuvor unerklärlichen Veränderungen der mitochondrialen Fehllokalisierung und des Vorhandenseins von Glückspartikeln führen können. Um diese Technik voranzubringen, könnten Wasserstoffperoxidkonzentrationen mit einer höheren oder niedrigeren Konzentration moduliert werden. Wenn ein zellulärer Effekt mit einer niedrigeren Konzentration gesehen wird, ist es möglich, dass der Stress-Phänotyp reversibel ist, indem er das Medium durch Complete Schneiders ersetzt. Verschiedene Zellstressoren wie Carbonylcyanid m-Chlorphenylhydrazone (CCCP), Arsenit oder einfacher Hitzeschock könnten sich als nützlich für allgemeine zelluläre Belastungen für andere subzelluläre Strukturen erweisen. Da die Live-Bildgebung von Ex-vivo-Geweben eine manuelle Manipulation und Inkubation in verschiedenen Medien erfordert, sollte diese Kontrolle eine nützliche Ergänzung sein, um sicherzustellen, dass alle Beobachtungen so nah wie möglich an der normalen Physiologie liegen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Jeremy Smyth für die bildgebende Unterstützung und Ann C. Shenk für Illustrationen, Produktion und Videographie. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (1R01GM127938 bis R.T.C.) unterstützt.
Active dry yeast | Red Star® | ||
CO2 gas | 99.9% purity | ||
CO2 pad | |||
Dissecting microscope, Nikon SMZ645 model | Nikon | ||
Dissecting needles – PrecisionGlide needles | BD | 305165 | B-D 21G1 size |
Dissecting needles – PrecisionGlide syringes | BD | 309657 | Luer-Lok tip, 3 mL size |
Dissecting needles – tungsten wire | Electron Microscopy Sciences | 73800 | |
Dumont #5 forceps (2 pairs) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
NI-150 High Intensity Illuminator | Nikon Instruments Inc. | ||
Gibco Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Fisher Scientific | 10082-147 | |
Gibco Schneider's Drosophila Media | Sigma-Aldrich | 21720-024 | |
Hydrogen peroxide solution, 30% (w/w) in H2O | Sigma-Aldrich | H1009 | |
Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Spinning disk microscope | Nikon | Equivalent scopes may also be used | |
Lonza BioWhittaker Antibiotics: Penicillin-Streptomycin mixtures | Fisher Scientific | 17-602E | |
MatTek Corporation Glass Bottom Dishes, 35 mm | Fisher Scientific | NC9344527 | |
Micropipettes and tips of appropiate size | Eppendorf | ||
Microcentrifuge tubes, 1.7 mL | VWR | 87003-294 | |
Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate (TMRE) | AnaSpec | AS-88061 | |
w[1118] | Bloomington Drosophila Stock Center | 5905 | Wild-type flies |
y w; clu[CA06604] | Available upon request. | Clu::GFP trap flies |