Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und Mesenchym/Bindegewebe von embryonalen 12,5 und 8 Wochen alten Mäusen
Summary
Wir haben ein verallgemeinertes Protokoll entwickelt, um eine große Menge hochwertiger Einzelzellen aus dem Epithel und Mesenchym/Bindegewebe embryonaler und erwachsener Mauszungen zu dissoziieren.
Abstract
Die Zelldissoziation war ein wesentliches Verfahren für Studien auf Einzelzellebene und/oder auf Zellpopulationsebene (z. B. Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Zellkultur). Die Gewinnung lebensfähiger, gesunder Zellen in großen Mengen ist von entscheidender Bedeutung, und die optimalen Bedingungen dafür sind vom Gewebe abhängig. Zellpopulationen im Zungenepithel und im darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe sind heterogen und die Gewebestrukturen variieren in verschiedenen Regionen und in unterschiedlichen Entwicklungsstadien. Wir haben Protokolle zur Isolierung von Zellen aus dem Zungenepithel der Maus und Mesenchym/Bindegewebe in den frühen Entwicklungsstadien [Embryonaltag 12,5 (E12,5)] und jungen Erwachsenen (8 Wochen) getestet. Eine saubere Trennung zwischen dem Epithel und dem darunter liegenden Mesenchym/Bindegewebe war leicht zu bewerkstelligen. Um Zellen weiter zu verarbeiten und zu isolieren, sind jedoch lebensfähige gesunde Zellen in großen Mengen und die sorgfältige Auswahl des enzymatischen Verdauungspuffers, der Inkubationszeit und der Zentrifugationsgeschwindigkeit und -zeit von entscheidender Bedeutung. Die Inkubation von getrenntem Epithel oder darunterliegendem Mesenchym/Bindegewebe in 0,25% Trypsin-EDTA für 30 min bei 37 °C, gefolgt von zentrifugation bei 200 x g für 8 min führte zu einer hohen Zellausbeute bei einer hohen Lebensfähigkeitsrate (>90%) unabhängig von den Mausstadien und Zungenregionen. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass sowohl dissoziierte epitheliale als auch mesenchymale/Bindegewebszellen aus embryonalen und adulten Zungen im zellkulturbasierten Medium mindestens 3 h überleben konnten, ohne dass die Zelllebensfähigkeit signifikant verringert wurde. Die Protokolle werden für Studien nützlich sein, die die Herstellung isolierter Zellen aus Mauszungen in frühen Entwicklungsstadien (E12.5) und jungen Erwachsenen (8 Wochen) erfordern, die eine Zelldissoziation aus verschiedenen Gewebekompartimenten erfordern.
Introduction
Die Säugetierzunge ist ein komplexes Organ, das für Geschmack, Sprechen und Lebensmittelverarbeitung entscheidend ist. Es besteht aus mehreren Arten von hochorganisierten Geweben, die durch Mesenchym / Bindegewebe unterteilt und von einem geschichteten Epithelblatt bedeckt sind, das Geschmackspapillen und Geschmacksknospen enthält. Zellpopulationen sowohl im Zungenepithel als auch im Mesenchym/Bindegewebe sind heterogen. Um die Funktionen und die Verteilung eines bestimmten Zelltyps in der Zunge besser zu verstehen, sind Studien mit dissoziierten Zellen notwendig. Zum Beispiel ist die Einzelzell-RNA-Sequenzierung eine leistungsfähige und hochdurchsatzartige Methode zur transkriptomischen Profilierung in einzelnen Zellen, die entwickelt wurde, um das Transkriptom komplexer Gewebe mit einer Einzelzellauflösung1,2,3,4zu verstehen. Die primäre Zellkultur hat sich als nützliches Werkzeug erwiesen, um die Funktion und Differenzierung von Stamm-/Vorläuferzellen für Geschmacksknospen zu untersuchen5,6. Diese Studien erfordern eine große Menge an qualitativ hochwertigen isolierten Zellpopulationen (z. B. ausreichende Gesamtzellzahl bei richtiger Konzentration und hoher Lebensfähigkeit).
Daher besteht die Notwendigkeit, Zellen aus verschiedenen Regionen des Lingualgewebes und in verschiedenen Entwicklungsstadien zu isolieren. Derzeit gibt es kein detailliertes Protokoll für die Zelldissoziation vom Zungenepithel und dem darunter liegenden Mesenchym / Bindegewebe. Hier berichten wir über eine optimierte Zelldissoziationsmethode, um Zellen für Experimente vorzubereiten, die eine hohe Qualität lebender Zellen erfordern, z. B. für die Einzelzell-RNA-Sequenzierung und primäre Stammzellkulturen. Wir fanden heraus, dass die Auswahl des enzymatischen Aufschlusspuffers, das sanfte Pipettieren, die Auswahl des Resuspensionsmediums und die optimale Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit entscheidend sind, um diese großen Mengen hochwertiger Zellen zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bisher gibt es kein detailliertes Protokoll für die Zelldissoziation aus dem Zungenepithel und dem darunter liegenden Mesenchym/ Bindegewebe. Dieses aktuelle Zelldissoziationsprotokoll bietet ein reproduzierbares Verfahren, um eine Einzelzellsuspension mit einer hohen Zelllebensfähigkeit (>90%) aus Mauszungengewebe, einschließlich Epithelblättern und Mesenchym-/Bindegewebe sowohl im embryonalen als auch im postnatalen Stadium, obwohl isolierte Zellen von E12.5 und erwachsenen Mäusen unterschiedlich groß sind. Zum B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von den National Institutes of Health mit den Fördernummern R01DC012308 und R21DC018089 an HXL unterstützt. Wir danken Brett Marshall (University of Georgia, Athens, GA) und Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) für technische Unterstützung und Beratung bezüglich der Zelldissoziation; an Francisca Gibson Burnley (University of Georgia, Athens, GA) für englische Bearbeitung.
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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