Summary

Disociación Celular Del Epitelio De La Lengua Y El Meténquima / Tejido Conectivo De Los Ratones Embrionarios-Día 12.5 Y 8-Semana-Viejo

Published: January 21, 2021
doi:

Summary

Hemos desarrollado un protocolo generalizado para disociar una gran cantidad de células individuales de alta calidad del epitelio y el meténquima / tejido conectivo de lenguas de ratón embrionarias y adultas.

Abstract

La disociación celular ha sido un procedimiento esencial para los estudios a nivel de células individuales y/o a nivel de población celular (por ejemplo, secuenciación de ARN unicelular y cultivo celular primario). Producir células viables y sanas en grandes cantidades es crítico, y las condiciones óptimas para hacerlo dependen del tejido. Las poblaciones celulares en el epitelio de la lengua y el tejido conectivo/meténquima subyacente son heterogéneos y las estructuras tisulares varían en diferentes regiones y en diferentes etapas de desarrollo. Hemos probado protocolos para aislar las células del epitelio de la lengua del ratón y del tejido del mesenchyme/conectivo en las etapas tempranas del desarrollo [día embrionario 12.5 (E12.5)] y del adulto joven (8 semanas). Una separación limpia entre el epitelio y el mesenchyme/el tejido conectivo subyacente era fácil de lograr. Sin embargo, para procesar y aislar aún más las células, el rendimiento de células sanas viables en grandes cantidades, y la selección cuidadosa de tampón de digestión enzimática, tiempo de incubación, y la velocidad y el tiempo de centrifugación son críticos. La incubación del epitelio separado o del tejido conectivo/del mesenchyme subyacente en el 0,25% Tripsina-EDTA durante 30 minutos en el °C 37, seguido por la centrifugación en 200 x g por 8 minutos dio lugar a un alto rendimiento de células en una alta tarifa de viabilidad (>90%) independientemente de las etapas del ratón y las regiones de la lengua. Por otra parte, encontramos que las células epiteliales y mesenquimales/conectivas disociadas del tejido de lengüetas embrionarias y adultas podrían sobrevivir en el medio cultivo-basado celular por lo menos 3 h sin una disminución significativa de la viabilidad de la célula. Los protocolos serán útiles para los estudios que requieren la preparación de células aisladas de lenguas de ratón en etapas de desarrollo temprano (E12.5) y adultos jóvenes (8 semanas) que requieren disociación celular de diferentes compartimentos tisulares.

Introduction

La lengua de los mamíferos es un órgano complejo crítico para el gusto, el habla y el procesamiento de alimentos. Se compone de múltiples tipos de tejidos altamente organizados compartimentados por el meténquima / tejido conectivo y cubiertos por una hoja epitelial estratificada que contiene papilas gustativas y papilas gustativas. Las poblaciones celulares tanto en el epitelio de la lengua como en el meténquima/tejido conectivo son heterogéneas. Para comprender mejor las funciones y la distribución de un tipo particular de células en la lengua, son necesarios estudios con células disociadas. Por ejemplo, la secuenciación de ARN unicelular es un método potente y de alto rendimiento para el perfilado transcriptómico en células individuales, que está diseñado para comprender el transcriptoma de tejidos complejos a una resolución unicelular1,2,3,4. El cultivo celular primario ha demostrado ser una herramienta útil para estudiar la función y diferenciación de las células madre/progenitoras para las papilas gustativas5,6. Estos estudios requieren una gran cantidad de poblaciones celulares aisladas de alta calidad (por ejemplo, suficiente número total de células con concentración adecuada y alta viabilidad).

Por lo tanto, existe la necesidad de aislar las células de diferentes regiones de los tejidos linguales y en diferentes etapas de desarrollo. Actualmente, no hay un protocolo detallado disponible para la disociación celular del epitelio de la lengua y el tejido conectivo/metanfimo subyacente. Aquí, se presenta un método de disociación celular optimizado para preparar las células para experimentos que requieren una alta calidad de las células vivas, tales como para la secuenciación de ARN unicelular y cultivos de células madre primarias. Encontramos que la selección de tampón de digestión enzimática, pipeteo suave, selección de medio de resuspensión, y el tiempo de centrifugación óptima y la velocidad son cruciales para generar estas grandes cantidades de células de alta calidad.

Protocol

El uso de animales (ratones C57BL/6 a lo largo del estudio) fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgia y estuvo de acuerdo con las Directrices de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales para la investigación. 1. Uso animal NOTA: Los ratones fueron criados y mantenidos en las instalaciones de animales del departamento de Ciencia Animal y Lechera de la Universidad de Georgia a 22 °C …

Representative Results

Separación del epitelio de la lengua del mesenquima/tejido conectivo subyacenteEn la lengua embrionaria del ratón, un boquete en el espacio subepitelial es visible después de la digestión apropiada de la enzima. Las hojas epiteliales de algunas lenguas se separan sin fuerza mecánica durante la incubación. En la lengua adulta del ratón, una inyección enzimática exitosa se indica por la hinchazón en las áreas inyectadas (Figura 1B<str…

Discussion

Hasta la fecha, no ha habido un protocolo detallado disponible para la disociación de la célula del epitelio de la lengüeta y del tejido conectivo/del mesenchyme/del tejido conectivo subyacentes. Este protocolo de disociación celular actual proporciona un procedimiento reproducible para generar una suspensión unicelular con una alta viabilidad celular (>90%) de los tejidos de la lengua del ratón, incluyendo las hojas epiteliales y los tejidos del mesenchyme/connective en las etapas embrionarias y postnatales aunque…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, número de subvención R01DC012308 y R21DC018089 a HXL. Damos las gracias a Brett Marshall (Universidad de Georgia, Athens, GA) y Egon Ranghini (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) por la asistencia técnica y la consulta con respecto a la disociación celular; a Francisca Gibson Burnley (Universidad de Georgia, Athens, GA) para la edición en inglés.

Materials

bovine serum albumin (BSA) Gold Biotechnology A-420-100
C57BL/6 mouse (C57BL/6J) The Jackson Laboratory 000664
collagenase (Collagenase A) Sigma-Aldrich 10103586001
culture dish (35 mm in diameter) Genesee Scientific 32-103G
culture dish (100 mm in diameter) Genesee Scientific 32-107G
dispase (Dispase II) Sigma-Aldrich 04942078001
dissecting scissors (Student Fine Scissors) Find Science Tool 91460-11
DMEM/F12 Gibco 11320033
fetal bovine serum (FBS) Hyclone C838U82
fine forceps (Dumount #3 Forceps) Find Science Tool 11293-00
hemocytometer Hausser Scientific 3520
inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) Life Technologies AMEX1000
low retention pipette tips METTLER TOLEDO 17014342
mini-scissors (Evo Spring Scissors) Fine Science Tool 15800-01
plastic warp VWR 46610-056
spatula (Moria Spoon) Fine Science Tool 10321-08
surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) Fine Science Tool 11223-20
Trypan blue Gibco 15250061
Tyrode’s solution Sigma-Aldrich T2145-10L made from Tyrode's salts
0.25% typsin-EDTA Gibco 25200056
0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) Hoefer 33946 made from 1 M PBS
0.22-μm syringe filter Genesee Scientific 25-243
70% ethanol Koptec 233919 made from 100% ethanol
1-mL syringe BD 8194938
5-mL low binding microcentrifuge tube Eppendorf 30122348
30-G needle BD 9193532
35-μm cell strainer Falcon 64750
70-μm cell strainer Falcon 64752

References

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Cite This Article
Yu, W., Ishan, M., Wang, Z., Liu, H. Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice. J. Vis. Exp. (167), e62163, doi:10.3791/62163 (2021).

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