Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması
Summary
Embriyonik ve yetişkin fare dillerinin epitel ve mezenkim/bağ dokusundan çok miktarda yüksek kaliteli tek hücreyi ayrıştırmak için genelleştirilmiş bir protokol geliştirdik.
Abstract
Hücre ayrışması, birey-hücre düzeyinde ve/veya hücre popülasyonu düzeyinde (örneğin, tek hücreli RNA dizilimi ve birincil hücre kültürü) çalışmalar için önemli bir prosedür olmuştur. Büyük miktarlarda uygulanabilir, sağlıklı hücreler elde etmek kritik öneme sahiptir ve bunu yapmak için en uygun koşullar dokuya bağlıdır. Dil epitel ve alttaki mezenkim/bağ dokusundaki hücre popülasyonları heterojendir ve doku yapıları farklı bölgelerde ve farklı gelişim evrelerinde farklılık gösterir. Erken gelişimsel [embriyonik gün 12.5 (E12.5)] ve genç yetişkin (8 haftalık) evrelerde fare dili epitel ve mezenkim/bağ dokusundan hücreleri izole etmek için protokolleri test ettik. Epitel ve alttaki mezenkim/bağ dokusu arasında temiz bir ayrım yapmak kolaydı. Bununla birlikte, hücreleri daha fazla işlemek ve izole etmek, büyük miktarlarda uygulanabilir sağlıklı hücreler elde etmek ve enzimatik sindirim tamponunun dikkatli seçimi, kuluçka süresi ve santrifüj hızı ve zamanı kritiktir. 37 °C’de 30 dakika boyunca %0,25 Trypsin-EDTA’da ayrılmış epitel veya alttaki mezenkime/bağ dokusunun inkübasyonu, ardından 8 dakika boyunca 200 x g’da santrifüjleme yüksek canlılık oranında (%>90) yüksek hücre verimi ile sonuçlandı. fare aşamaları ve dil bölgeleri ne olursa olsun. Ayrıca, embriyonik ve yetişkin dillerinden hem ayrışmış epitel hem de mezenkimal/bağ dokusu hücrelerinin hücre kültürüne dayalı ortamda hücre canlılığında önemli bir azalma olmadan en az 3 saat hayatta kalabileceğini bulduk. Protokoller, erken gelişimsel (E12.5) ve farklı doku bölmelerinden hücre ayrışması gerektiren genç yetişkin (8 haftalık) aşamalarda fare dillerinden izole hücrelerin hazırlanmasını gerektiren çalışmalar için yararlı olacaktır.
Introduction
Memeli dili tat, konuşma ve gıda işleme için kritik olan karmaşık bir organdır. Mezenkime/bağ dokusu ile bölümlere ayrılmış ve tat papilla ve tat tomurcukları içeren tabakalı bir epitel levha ile kaplanmış çok sayıda yüksek organize doku türünden oluşur. Hem dil epitel hem de mezenkim/bağ dokusundaki hücre popülasyonları heterojendir. Dildeki belirli bir hücre türünün işlevlerini ve dağılımını daha iyi anlamak için, ayrışmış hücrelerin kullanılarak yapılan çalışmalar gereklidir. Örneğin, tek hücreli RNA dizilimi, tek hücreli çözünürlükte karmaşık dokunun transkriptom’u anlamak için tasarlanmış, tek tek hücreli hücrelerde transkriptomik profil oluşturma için güçlü ve yüksek aktarım hızına sahip biryöntemdir. Birincil hücre kültürünün, tat tomurcukları için kök/ progenitör hücrelerin işlevini ve farklılaşmasını incelemek için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır5,6. Bu çalışmalar çok miktarda yüksek kaliteli izole hücre popülasyonu gerektirir (örneğin, uygun konsantrasyon ve yüksek canlılık ile yeterli toplam hücre sayısı).
Bu nedenle, lingual dokuların farklı bölgelerinden ve farklı gelişim aşamalarında hücreleri izole etmeye ihtiyaç vardır. Şu anda, dil epitelinden ve alttaki mezenkim/ bağ dokusundan hücre ayrışması için ayrıntılı bir protokol bulunmamaktadır. Burada, hücreleri tek hücreli RNA dizilimi ve birincil kök hücre kültürleri gibi yüksek kalitede canlı hücreler gerektiren deneylere hazırlamak için optimize edilmiş bir hücre ayrıştırma yöntemi rapor ediyoruz. Enzimatik sindirim tamponu seçimi, nazik pipetleme, resüspenzyon ortamının seçimi ve bu büyük miktarlarda yüksek kaliteli hücre üretmek için optimum santrifüj süresi ve hızının çok önemli olduğunu gördük.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bugüne kadar, dil epitelinden ve alttaki mezenkim/ bağ dokusundan hücre ayrışması için ayrıntılı bir protokol mevcut olmamıştır. Bu geçerli hücre ayrıştırma protokolü, yüksek hücre canlılığı (%>90) olan tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için tekrarlanabilir bir yordam sağlar E12.5 ve yetişkin farelerden izole edilmiş hücreler farklı olsa da hem embriyonik hem de doğum sonrası evrelerde epitel levhalar ve mezenkim/bağ dokuları da dahil olmak üzere fare dili dokularından. Örneğ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, R01DC012308 ve R21DC018089 hibe numarası tarafından HXL’ye desteklendi. Brett Marshall (Georgia Üniversitesi, Atina, GA) ve Egon Ranghini’ye (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) hücre ayrışması ile ilgili teknik yardım ve danışmanlık için teşekkür ederiz; İngilizce düzenleme için Francisca Gibson Burnley’e (Georgia Üniversitesi, Atina, GA).
Materials
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
- Grada, A., Weinbrecht, K. Next-generation sequencing: methodology and application. The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11 (2013).
- Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing. Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).
- Schaum, N., et al. Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium. Nature. 562 (7727), 367 (2018).
- Sukumaran, S. K., et al. Whole transcriptome profiling of taste bud cells. Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Ren, W., et al. Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
- Ren, W., et al. Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).
- Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -. X. Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).
- Nguyen-Ngoc, K. -. V., et al. . Tissue Morphogenesis. , 135-162 (2015).
- Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate. Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).
