JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Published: March 14, 2021
doi:
10.3791/62177
, , ,
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

Summary

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro’yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Abstract

Evrimsel olarak korunmuş oksisterol bağlayıcı protein (OSBP) ile ilişkili proteinler (ORP)/OSBP homologları (Oş) ailesinin birkaç üyesinin son zamanlarda maya ve insan hücrelerinde yeni bir lipit transfer proteini (LTP) grubunu temsil ettiği bulunmuştur. Fosfatidiylinositol 4-fosfat (PI(4)P) değişim döngüleri ile endoplazmik reticulumdan (ER) plazma membranlarına (PM) fosfatidiylserine (PS) aktarırlar. Bu bulgu, sinyalizasyon işlemleri için kritik olan PS’nin hücre boyunca nasıl dağıtıldığının ve bu işlem ile fosfoinositid (PIP) metabolizması arasındaki bağlantının araştırılmasının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Yeni floresan bazlı protokollerin geliştirilmesi, bu yeni hücresel mekanizma in vitro’nun moleküler düzeyde keşfedilmesinde ve karakterizasyonunda etkili olmuştur. Bu makale, bir proteinin PS veya PI(4)P çıkarma yeteneğini ölçmek ve bu lipitleri yapay zarlar arasında aktarmak için floresan etiketli iki lipit sensörünün, NBD-C2Lact ve NBD-PHFAPP’ınüretimini ve kullanımını açıklamaktadır. İlk olarak, protokol bu iki yapının yüksek saflıkta örneklerinin nasıl üretılacağını, etiketlenerek ve elde edilir. İkinci olarak, bu makale, bir proteinin Osh6p’yi vaka çalışması olarak kullanarak lipozomlardan PS veya PI(4)P çıkarıp çıkarabileceğini belirlemek için bu sensörlerin floresan mikro plaka okuyucu ile nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, bu protokol, tanımlanmış lipid bileşiminin lipozomları arasındaki PS/PI(4)P değişiminin kinetiğinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini ve standart bir florometre kullanılarak floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile lipid transfer oranlarının nasıl belirleneceğini göstermektedir.

Introduction

Lipitlerin farklı membranlar arasında ve ökaryotik hücrelerin zarları içinde kesin dağılımı1,2 derin biyolojik etkilere sahiptir. LTP’lerin nasıl çalıştığının şifresini çözmek hücre biyolojisinde önemli bir konudur3,4,5,6ve in vitro yaklaşımlar bu sorunu ele almada büyük değere sahiptir 7 ,8,9,10,11. Burada, birkaç ORP/Osh proteininin PS/PI(4)P hücre zarları12 arasındaki değişimi etkilediğini ve böylece yeni bir LTP sınıfı oluşturduğunu belirlemede etkili olan in vitro,floresan tabanlı bir strateji sunulmuştur. PS, ökaryotik hücrelerde toplam membran lipitlerinin% 2-10’unu temsil eden aniyonik bir gliserofsfolipiddir13,14,16. Sırasıyla17, 18,19 gliserofosfolipidlerin% 5-7’sini ve% 30’unu temsil ettiği ER ve PM arasında birgradyanboyuncadağıtılır. Ayrıca, PS esasen PM’nin sitosolik broşüründe yoğunlaşmıştır. Bu birikme ve PM’deki PS’nin düzensiz bölümü hücresel sinyal işlemleri için kritiktir19. PS moleküllerinin negatif yükü nedeniyle, PM’nin sitosolik broşürü, diğer organellerin sitozolitik broşürü 1,2,19,20’dençok daha anioniktir. Bu, elektrostatik kuvvetler aracılığıyla işe alıma olanak sağlar, miristosilat alanin bakımından zengin C-kinaz substratı (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rat sarkom viral onkogen (K-Ras)23ve Ras ile ilgili C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1)24 gibi pozitif yüklü amino asitler ve lipidik kuyruk içeren sinyal proteinleri.

PS ayrıca geleneksel protein kinaz C tarafından stereoselektif bir şekilde C2 etki alanı25 aracılığıyla tanınır. Ancak, PS sentezlendi ER26, rolünü oynayabilmesi için PM’ye dışa aktarılması gerektiğini gösterir. Mayada, Osh6p ve Osh7p’nin PS’yi ACIL’den PM27’yeaktardığı bulguya kadar bunun nasıl19’a başarıldığı bilinmiyordu. Bu LTP’ler, kurucu üyesi OSBP olan ve bir lipid molekülü barındırmak için OSBP ile ilgili bir etki alanını (ORD) bir ceple entegre eden proteinler (insanda ORP’ler, mayadaki Oş proteinleri) içeren ökaryotlarda evrimsel olarak korunmuş bir aileye aittir. Osh6p ve Osh7p, yalnızca yapısal özellikleri PS’yi özellikle bağlamak ve membranlar arasında aktarmak için uyarlanmış bir ORD’den oluşur. Bununla birlikte, bu proteinlerin PS’yi acil servisten PM’ye nasıl aktardığı belirsizdi. Osh6p ve Osh7p, PI(4)P’yi alternatif bir lipid ligand12olarak hapsedebilir. Mayada PI(4)P, Golgi ve PM’deki fosfatidylinositol’den (PI) sırasıyla PI 4-kinaz, Pik1p ve Stt4p ile sentezlenmiştir. Buna karşılık, ER membranında PI(4)P yoktur, çünkü bu lipit Sac1p fosfataz tarafından PI’ye hidrolize edilir. Bu nedenle, hem ER/Golgi hem de ER/PM arabirimlerinde bir PI(4)P gradyanı bulunur. Osh6p ve Osh7p, bu iki membran arasında bulunan PI(4)P gradyanını kullanarak PS/PI(4)P değişim döngüleri aracılığıyla PS’den PM’ye TRANSFER12.

Bir döngü içinde, Osh6p ACIL’den PS çıkarır, PM’de PI(4)P için PS değiştirir ve başka bir PS molekülü çıkarmak için PI(4)P’yi ER’ye geri aktarır. Osh6p / Osh7p ist2pile etkileşime girer 28, ER membranını ve PM’yi birbirine bağlayan ve yakın bir hale getiren birkaç proteinden biri maya29,30,31’deER-PM temas siteleri oluşturmak için. Ek olarak, Osh6p’nin negatif yüklü membranlarla ilişkisi, protein lipid ligandlarından birini elektrostatik özelliklerini değiştiren konformasyonsal bir değişiklik nedeniyle çıkarır çıkarmaz zayıflar32. Bu, membran tutma süresini kısaltarak Osh6p’ye yardımcı olur, böylece lipid transfer aktivitesinin verimliliğini korur. Ist2p’ye bağlama ile birlikte, bu mekanizma Osh6p/7p’nin ER/PM arabiriminde lipid değişimini hem hızlı hem de doğru bir şekilde yürütmesine izin verebilir. İnsan hücrelerinde, ORP5 ve ORP8 proteinleri ER-PM temas bölgelerinde PS/PI(4)P değişimini farklı mekanizmalar aracılığıyla yürütür33. Osh6p’ye benzeyen merkezi bir ORD’ye sahiptirler, ancak doğrudan bir C terminali transmembransegmenti 33 aracılığıyla ACIL’ye bağlanırlar ve PI(4)P ve PI(4,5)P233 , 34,35‘i tanıyan bir N terminali Pleckstrin homolojisi (PH) etki alanı aracılığıyla PM’ye yanaşırlar. ORP5/8, PS’yi aktarmak için PI(4)P kullanır ve ORP5/8’in PM PI(4,5)P2 seviyelerini ayrıca düzenlediği ve muhtemelen sinyal yollarını modüle ettiği gösterilmiştir. Buna karşılık, PI(4)P ve PI(4,5)P2 seviyelerindeki bir düşüş, bu proteinler PIP’e bağlı bir şekilde PM ile ilişkili olduğu için ORP5 / ORP8 aktivitesini düşürür. Lenz-Majewski sendromuna yol açan anormal derecede yüksek PS sentezi, ORP5/836aracılığıyla PI(4)P seviyelerini etkiler. Her iki proteinin aktivitesi engellendiğinde, PS PM’de daha az bol hale gelir ve proteinlerin onkojenik yeteneğini düşürür37.

Tersine, ORP5 aşırı ifade kanser hücre invazyonunu ve metastatik süreçleri teşvik ediyor gibi görünüyor38. Bu nedenle, ORP5/8 aktivitesindeki değişiklikler lipid homeostazındaki değişikliklerle hücresel davranışı ciddi şekilde değiştirebilir. Ayrıca, ORP5 ve ORP8 ER-mitokondri temas alanlarını işgal ediyor ve muhtemelen PS39sağlayarak bazı mitokondriyal işlevleri koruyor. Ayrıca ORP5, PS/PI(4)P exchange40ile LIPID damlacıklarına PS teslim etmek için ER-lipid damlacık iletişim sitelerine yerelleştirir. Burada açıklanan strateji, (i) PS ve PI(4)Lipozomlardan P ekstraksiyonunu ve (ii) LIPOMLAR ARASıNDAKI PS ve PI(4)P naklini ölçmek için Osh6p/Osh7p12,32’nin PS/PI(4)P değişim aktivitesini kurmak ve analiz etmek için tasarlanmıştır ve diğer gruplar tarafından ORP5/ORP835 ve diğer LTP10’larınaktivitesini analiz etmek için kullanılmıştır. 41. Bir floresan plaka okuyucu, standart bir L-format spektrofluorometre ve sırasıyla PS ve PI(4)P’yi algılayabilen iki floresan sensör, NBD-C2Lact ve NBD-PHFAPPkullanımına dayanmaktadır.

NBD-C2Lact, glikoprotein, lactadherin’in C2 etki alanına karşılık gelir, bu da varsayılan PS bağlama bölgesinin yakınında benzersiz bir çözücüye maruz kalan sistein içerecek şekilde yeniden tasarlanmıştır; polariteye duyarlı bir NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) floroforu bu kalıntıya yaygın olarak bağlıdır (Şekil 1A)12. Daha kesin olmak gerekirse, lactadherin C2 etki alanı (Bos taurus, UniProt: Q95114, kalıntılar 270-427) Escherichia coliglutatyon S-transferaz (GST) ile füzyon ifade etmek üzere bir pGEX-4T3 vektör içine klonlanmıştır. C2Lact dizisi daha sonra iki solventle erişilebilir sistein kalıntısını (C270, C427) alanin kalıntıları ile ve daha sonra N,N’-dimetil-ile etiketlenebilen putatif PS-bağlama bölgesinin (H352C mutasyonu) yakınındaki bir bölgeye sistein kalıntısı sokmak için N-(iodoacetyl)-N’-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etilen diamin (IANBD) 12. GST proteini ile C2 alanının N-terminusu arasında trombin için bir bölünme bölgesi bulunur. Önemli bir avantaj, bu etki alanının PS’yi bilinen diğerC2alan adlarına veya Annexin A542’yeaykırı olarak Ca 2+ bağımsız bir şekilde seçici olarak tanımasıdır. NBD-PHFAPP, PI(4)P bağlama bölgesinin yakınındaki bir NBD grubu ile etiketlenebilen tek bir solvent maruziyeti sistein içerecek şekilde yeniden tasarlanmış insan dört fosfat adaptör proteini1’in (FAPP1)PH etki alanından türetilmiştir ( Şekil 1A )43. İnsan FAPP proteininin PH etki alanının nükleotid dizisi (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]), bir GST etiketiyle birlikte ifade edilecek bir pGEX-4T3 vektörüne klonlanmıştır. PHFAPP dizisi, protein43’ünmembran bağlayıcı arayüzüne benzersiz bir sistein kalıntısı eklemek için değiştirilmiştir. Ayrıca, proteazlara erişilebilirliği sağlamak için trombin bölünme bölgesi ile PH alanının N-terminus’u arasında dokuz kalıntılı bir bağlayıcı getirilmiştir.

Lipozomlardan PS ekstraksiyonunu ölçmek için NBD-C2Lact, eser miktarda PS içeren fosfatidiylcholine (PC) yapılmış lipozomlarla karıştırılır. PS’ye olan yakınlığı nedeniyle, bu yapı lipozomlara bağlanır ve NBD floroforu, zarın hidrofobik ortamıyla temas ettikçe polaritede bir değişiklik yaşar ve bu da mavi kayma ve floresan artışı sağlar. PS neredeyse tamamen bir stoichiometric LTP miktarı ile ayıklanırsa, prob lipozomlarla ilişkilendirmez ve NBD sinyali daha düşüktür (Şekil 1B)32. Bu sinyal farkı, bir LTP’nin(örneğin, Osh6p) PS’yi ayıklayıp ayıklamadığını belirlemek için kullanılır. Benzer bir strateji, daha önce açıklandığı gibi PI(4)P ekstraksiyonunu (Şekil 1B) ölçmek için NBD-PHFAPP ile kullanılır12,32. (i) SıRASıYLA ER membranını ve PM’yi taklit eden LA’dan LB lipozomlarına PS taşımacılığını ve (ii) PI(4)P taşımasını ters yönde ölçmek için iki FRET tabanlı test tasarlanmıştır. Bu tahliller PS/PI(4)P değişimini ölçmek için aynı koşullar(yani aynı tampon, sıcaklık ve lipid konsantrasyonu) altındagerçekleştirilir. PS taşımacılığını ölçmek için, NBD-C2Lact PC’den oluşan L A lipozomları ile karıştırılır ve 5 mol% PS ve 2 mol% 5 mol PI (4) P içeren floresan rhodamin etiketli fosfatidylethanolamine (Rhod-PE) ve LB lipozomları ile karıştırılır.

Sıfır noktasında, Rhod-PE’li FRET, NBD floresanını bastırır. PS LA’dan LB lipozomlarına taşınırsa(örneğin, Osh6p enjekte edildikten sonra), NBD-C2Lakt moleküllerinin LA’dan LB lipozomlarına translokasyonu nedeniyle hızlı bir söndürme meydana gelir (Şekil 1C). Erişilebilir PS miktarı göz önüne alındığında, NBD-C2Lact esasen deney boyunca zara bağlı bir durumda kalır12. Bu nedenle, NBD sinyalinin yoğunluğu, NBD-C2Lakt’in LA ve LB lipozomları arasındaki dağılımıyla doğrudan ilişkilidir ve ne kadar PS aktarıldığını belirlemek için kolayca normalleştirilebilir. PI(4)P’nin ters yönde transferini ölçmek için, NBD-PHFAPP LA ve LB lipozomları ile karıştırılır; Sadece PI(4)P içeren LB lipozomlarına bağlandığı, ancak Rhod-PE’ye bağlanmadığı göz önüne alındığında, floresan yüksektir. PI(4)P LA lipozomlarına transfer edilirse, bu lipozomlara doğru hareket eder ve Rhod-PE ile FRET nedeniyle sinyal azalır (Şekil 1C). Sinyal, ne kadar PI(4)P aktarıldığını belirlemek için normalleştirilir43.

Protocol

1. NBD-C2Laktının Saflaştırılması NOT: Bu protokol bakterileri kırmak için bir hücre bozucunun kullanımını detaylandırsa da, diğer liziz stratejilerini(örneğin, bir Fransız basını) kullanmak için değiştirilebilir. Saflaştırmanın başlangıcında, sistein oksidasyonunu önlemek için taze gazdan arındırılmış, filtrelenmiş ve 2 mM dithiothreitol (DTT) ile desteklenmiş tampon kullanılması zorunludur. Bununla birlikte, protein etiketleme adımı …

Representative Results

Şekil 1: Floresan lipit sensörlerinin ve in vitro tahlillerin açıklaması. (A) Sığır laktadherin C2 etki alanının kristal yapısına (PDB ID: 3BN648)ve insanFAPP1 proteininin PH alanının NMR yapısına dayanan NBD-C2Lact ve NBD-PH FAPP’ın üç boyutlu modelleri (PDB ID: 2KCJ<s…

Discussion

Bu tahlillerin sonuçları doğrudan floresan lipid sensörlerinin sinyallerine dayanır. Bu nedenle, NBD ile 1:1 oranında etiketlenen ve serbest NBD florofor kontaminasyonu olmadan etiketlenen bu probların saflaştırılması bu protokolde kritik bir adımdır. Muayene edilen LTP’nin düzgün bir şekilde katlanıp katlanmadığını ve toplanmadığını kontrol etmek de zorunludur. Bu LTP’nin bu lipitleri verimli bir şekilde çıkarıp çıkarmadığını düzgün bir şekilde ölçmek için ekstraksiyon testlerind…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dr. A. Cuttriss’e el yazmasını dikkatli bir şekilde düzelttikleri için minnettarız. Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı hibe ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) ve CNRS tarafından finanse edilmektedir.

Materials

 L-cysteine ≥97 % (FG)  Sigma W326305-100G Prepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3 Wheaton W224681
4 mm-diameter glass beads Sigma Z265934-1EA
50 mL conical centrifuge tube Falcon
ÄKTA purifier GE healthcare FPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDa Merck UFC800324, UFC801024
Ampicillin Prepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
Bestatin Sigma B8385-10mg
BL21 Gold Competent Cells Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL) Avanti Polar Lipids 810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon Lipids P-4016-3 Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL) Avanti Polar Lipids 840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL) Avanti Polar Lipids 850375C-500mg
CaCl2  Sigma Prepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell Disruptor Constant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISO Carlo Erba 438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail Roche 5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powder Roche 10104159001
DTT Euromedex EU0006-B Prepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm). Biorad 7321010
Electroporation cuvette 2 mm Ozyme EP102
Electroporator Eppendorf 2510 Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubes Beckman Spinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experiment Hamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutions Hamilton 1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beads GE Healthcare 17-0756-05
Glycerol (99% pure) Sigma G5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pure Sigma H3375-500G
Illustra NAP 10 desalting column GE healthcare GE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Euromedex EU0008-B Prepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-Acetate Prolabo 26664.293
Lennox LB Broth medium without glucose Prepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogen Linde
Methanol (MeOH) ≥99.8% VWR 20847.24
MgCl2 Sigma Prepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-Binding Greiner Bio-one 655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringes Avanti Polar Lipids 610023
Monochromator-based fluorescence plate reader TECAN M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide) Molecular Probes Dissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaCl Sigma S3014-1KG
PBS 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass) Duran Group
Pepstatin Sigma p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid Available on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmid Available on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC) Sigma P7626-25g Prepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
Phosphoramidon Sigma R7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µm Avanti Polar Lipids 610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir) Biorad 7311550
Prefilters (10 mm in diameter). Avanti Polar Lipids 610014
PyMOL http://pymol.org/ Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL) Hellma
Quartz cuvettes Hellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427R Eppendorf
Rotary evaporator Buchi B-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL) Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL) Eppendorf
SYPRO orange fluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
Thermomixer Starlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMA Sigma 10602400001 Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pure MP 819623
Ultracentrifuge L90K Beckman
UV/Visible absorbance spectrophotometer SAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring device Jasco or Shimadzu Jasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bath Julabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HR GE healthcare
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellular territories in determining specificity. Developmental Cell. 23 (5), 886-895 (2012).
  3. Prinz, W. A. Lipid trafficking sans vesicles: where, why, how. Cell. 143 (6), 870-874 (2010).
  4. Holthuis, J. C., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Wong, L. H., Copic, A., Levine, T. P. Advances on the transfer of lipids by lipid transfer proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 516-530 (2017).
  6. Wong, L. H., Gatta, A. T., Levine, T. P. Lipid transfer proteins: the lipid commute via shuttles, bridges and tubes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (2), 85-101 (2019).
  7. Iaea, D. B., Dikiy, I., Kiburu, I., Eliezer, D., Maxfield, F. R. STARD4 membrane interactions and sterol binding. Biochemistry. 54 (30), 4623-4636 (2015).
  8. Wilhelm, L. P., et al. STARD3 mediates endoplasmic reticulum-to-endosome cholesterol transport at membrane contact sites. The EMBO Journal. 36 (10), 1412-1433 (2017).
  9. Bian, X., Saheki, Y., De Camilli, P. Ca(2+) releases E-Syt1 autoinhibition to couple ER-plasma membrane tethering with lipid transport. The EMBO Journal. 37 (2), 219-234 (2018).
  10. Horenkamp, F. A., Valverde, D. P., Nunnari, J., Reinisch, K. M. Molecular basis for sterol transport by StART-like lipid transfer domains. The EMBO Journal. 37 (6), 98002 (2018).
  11. Jentsch, J. A., et al. Structural basis of sterol binding and transport by a yeast StARkin domain. The Journal of Biological Chemistry. 293 (15), 5522-5531 (2018).
  12. Moser von Filseck, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. Phosphatidylserine transport by ORP/Osh proteins is driven by phosphatidylinositol 4-phosphate. Science. 349 (6246), 432-436 (2015).
  13. Daum, G., et al. Systematic analysis of yeast strains with possible defects in lipid metabolism. Yeast. 15 (7), 601-614 (1999).
  14. Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
  15. Leidl, K., Liebisch, G., Richter, D., Schmitz, G. Mass spectrometric analysis of lipid species of human circulating blood cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1781 (10), 655-664 (2008).
  16. Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
  17. Vance, J. E., Steenbergen, R. Metabolism and functions of phosphatidylserine. Progress in Lipid Research. 44 (4), 207-234 (2005).
  18. Zinser, E., et al. Phospholipid synthesis and lipid composition of subcellular membranes in the unicellular eukaryote Saccharomyces cerevisiae. Journal of Bacteriology. 173 (6), 2026-2034 (1991).
  19. Leventis, P. A., Grinstein, S. The distribution and function of phosphatidylserine in cellular membranes. Annual Review of Biophysics. 39, 407-427 (2010).
  20. Yeung, T., et al. Membrane phosphatidylserine regulates surface charge and protein localization. Science. 319 (5860), 210-213 (2008).
  21. Kim, J., Shishido, T., Jiang, X., Aderem, A., McLaughlin, S. Phosphorylation, high ionic strength, and calmodulin reverse the binding of MARCKS to phospholipid vesicles. Journal of Biological Chemistry. 269 (45), 28214-28219 (1994).
  22. Sigal, C. T., Zhou, W., Buser, C. A., McLaughlin, S., Resh, M. D. Amino-terminal basic residues of Src mediate membrane binding through electrostatic interaction with acidic phospholipids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (25), 12253-12257 (1994).
  23. Gal Bivona, T., et al. PKC regulates a farnesyl-electrostatic switch on K-Ras that promotes its association with Bcl-XL on mitochondria and induces apoptosis. Molecular Cell. 21 (4), 481-493 (2006).
  24. Finkielstein, C. V., Overduin, M., Capelluto, D. G. Cell migration and signaling specificity is determined by the phosphatidylserine recognition motif of Rac1. The Journal of Biological Chemistry. 281 (37), 27317-27326 (2006).
  25. Bolsover, S. R., Gomez-Fernandez, J. C., Corbalan-Garcia, S. Role of the Ca2+/Phosphatidylserine Binding Region of the C2 Domain in the Translocation of Protein Kinase Cα to the Plasma Membrane. Journal of Biological Chemistry. 278 (12), 10282-10290 (2003).
  26. Vance, J. E., Tasseva, G. Formation and function of phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta. 1831 (3), 543-554 (2013).
  27. Maeda, K., et al. Interactome map uncovers phosphatidylserine transport by oxysterol-binding proteins. Nature. 501 (7466), 257-261 (2013).
  28. D’Ambrosio, J. M., et al. Osh6 requires Ist2 for localization to ER-PM contacts and efficient phosphatidylserine transport in budding yeast. Journal of Cell Science. 133 (11), 243733 (2020).
  29. Manford, A. G., Stefan, C. J., Yuan, H. L., Macgurn, J. A., Emr, S. D. ER-to-plasma membrane tethering proteins regulate cell signaling and ER morphology. Developmental Cell. 23 (6), 1129-1140 (2012).
  30. Collado, J., et al. Tricalbin-mediated contact sites control ER curvature to maintain plasma membrane integrity. Developmental Cell. 51 (4), 476-487 (2019).
  31. Hoffmann, P. C., et al. Tricalbins contribute to cellular lipid flux and form curved ER-PM contacts that are bridged by rod-shaped structures. Developmental Cell. 51 (4), 488-502 (2019).
  32. Lipp, N. F., et al. An electrostatic switching mechanism to control the lipid transfer activity of Osh6p. Nature Communications. 10 (1), 3926 (2019).
  33. Chung, J., et al. INTRACELLULAR TRANSPORT. PI4P/phosphatidylserine countertransport at ORP5- and ORP8-mediated ER-plasma membrane contacts. Science. 349 (6246), 428-432 (2015).
  34. Sohn, M., et al. PI(4,5)P2 controls plasma membrane PI4P and PS levels via ORP5/8 recruitment to ER-PM contact sites. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1797-1813 (2018).
  35. Ghai, R., et al. ORP5 and ORP8 bind phosphatidylinositol-4, 5-biphosphate (PtdIns(4,5)P 2) and regulate its level at the plasma membrane. Nature Communications. 8 (1), 757 (2017).
  36. Sohn, M., et al. Lenz-Majewski mutations in PTDSS1 affect phosphatidylinositol 4-phosphate metabolism at ER-PM and ER-Golgi junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4314-4319 (2016).
  37. Kattan, W. E., et al. Targeting plasma membrane phosphatidylserine content to inhibit oncogenic KRAS function. Life Science Alliance. 2 (5), 00431 (2019).
  38. Du, X., Turner, N., Yang, H. The role of oxysterol-binding protein and its related proteins in cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 81, 149-153 (2018).
  39. Galmes, R., et al. ORP5/ORP8 localize to endoplasmic reticulum-mitochondria contacts and are involved in mitochondrial function. EMBO reports. 17 (6), 800-810 (2016).
  40. Du, X., et al. ORP5 localizes to ER-lipid droplet contacts and regulates the level of PI(4)P on lipid droplets. The Journal of Cell Biology. 219 (1), 201905162 (2020).
  41. Wang, H., et al. ORP2 delivers cholesterol to the plasma membrane in exchange for phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PI(4,5)P2). Molecular Cell. 73 (3), 458-473 (2019).
  42. Kay, J. G., Grinstein, S. Sensing phosphatidylserine in cellular membranes. Sensors (Basel). 11 (2), 1744-1755 (2011).
  43. Moser von Filseck, J., Vanni, S., Mesmin, B., Antonny, B., Drin, G. A phosphatidylinositol-4-phosphate powered exchange mechanism to create a lipid gradient between membranes. Nature Communications. 6, 6671 (2015).
  44. Wills, R. C., Goulden, B. D., Hammond, G. R. V. Genetically encoded lipid biosensors. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1526-1532 (2018).
  45. Raychaudhuri, S., Im, Y. J., Hurley, J. H., Prinz, W. A. Nonvesicular sterol movement from plasma membrane to ER requires oxysterol-binding protein-related proteins and phosphoinositides. The Journal of Cell Biology. 173 (1), 107-119 (2006).
  46. Lenoir, M., et al. Structural basis of wedging the Golgi membrane by FAPP pleckstrin homology domains. EMBO reports. 11 (4), 279-284 (2010).
  47. Liu, Y., Kahn, R. A., Prestegard, J. H. Interaction of Fapp1 with Arf1 and PI4P at a membrane surface: an example of coincidence detection. Structure. 22 (3), 421-430 (2014).
  48. Shao, C., Novakovic, V. A., Head, J. F., Seaton, B. A., Gilbert, G. E. Crystal structure of lactadherin C2 domain at 1.7A resolution with mutational and computational analyses of its membrane-binding motif. The Journal of Biological Chemistry. 283 (11), 7230-7241 (2008).
  49. Lipp, N. F., Ikhlef, S., Milanini, J., Drin, G. Lipid exchangers: cellular functions and mechanistic links with phosphoinositide metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 663 (2020).
  50. Venditti, R., et al. Molecular determinants of ER-Golgi contacts identified through a new FRET-FLIM system. The Journal of Cell Biology. 218 (3), 1055-1065 (2019).
  51. Pemberton, J. G., et al. Defining the subcellular distribution and metabolic channeling of phosphatidylinositol. The Journal of Cell Biology. 219 (3), (2020).
  52. Nakanishi, H., de los Santos, P., Neiman, A. M. Positive and negative regulation of a SNARE protein by control of intracellular localization. Molecular Biology of the Cell. 15 (4), 1802-1815 (2004).
  53. Maekawa, M., Yang, Y., Fairn, G. D. Perfringolysin O theta toxin as a tool to monitor the distribution and inhomogeneity of cholesterol in cellular membranes. Toxins. 8 (3), 67 (2016).

Tags

FluorescencePhosphatidylserinePhosphatidylinositol 4-phosphateLipid TransferMembraneLiposomesNBD-C2 LactLipid SensorLipid Transfer ProteinNBD-PH FAPP ProbePI(4)P Extraction AssayHEPES Potassium Acetate BufferMagnesium ChloridePhosphatidylcholinePhosphatidylethanolamine
check_url/62177?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Ikhlef, S., Lipp, N., Magdeleine, M., Drin, G. Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes. J. Vis. Exp. (169), e62177, doi:10.3791/62177 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image