פרוטוקול זה מתמקד בהכנת כרומטין מרקמות קפואות והוא מתאים ל- Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) ואחריו ניתוח PCR כמותי (X-ChIP-qPCR) או גישות ריצוף מהדור הבא (X-ChIP-seq).
Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) היא טכניקה נפוצה להערכת רמות סימני היסטון ותפוסת גורמי שעתוק על כרומטין, מארח ו / או פתוגן. הכנת כרומטין מרקמות יוצרת אתגרים נוספים שיש להתגבר עליהם כדי להשיג פרוטוקולים ניתנים לשחזור ואמינים הדומים לאלה המשמשים לתרבית תאים. שיבוש וקיבוע רקמות הם צעדים קריטיים להשגת גזירה יעילה של כרומטין. דו-קיום של סוגי תאים וצבירים שונים עשוי גם לדרוש זמני גזירה שונים כדי להגיע לגודל מקטע אופטימלי ומעכב את יכולת השחזור של הגזירה. מטרת שיטה זו היא להשיג תכשירי כרומטין מארח אמינים וניתנים לשחזור מרקמה קפואה (כבד) המתאימים הן ליישומי ChIP-qPCR והן ליישומי ריצוף מהדור הבא (NGS). ראינו כי השילוב של כתישת רקמת חנקן נוזלית ואחריה הומוגניזציה מוביל ליכולת שחזור מוגברת בהשוואה להומוגניזציה בלבד, שכן הוא מספק תרחיף המורכב בעיקר מתאים בודדים מנותקים הניתנים לגזירה יעילה. יתר על כן, שלב הקיבוע צריך להתבצע תחת סיבוב מתון כדי לספק crosslinking הומוגני. החומר הקבוע מתאים אז לבידוד גרעינים מבוססי חיץ, כדי להפחית את הזיהום של חלבון ציטופלזמי ודנ”א פתוגן ורנ”א (כאשר ישים), תוך הימנעות משיפועי צנטריפוגות גוזלות זמן. הסוניקציה הבאה תשלים ליזה גרעינית ותגזור את הכרומטין, ותפיק טווח גדלים מסוים בהתאם לתנאי הגזירה שנבחרו. טווח הגדלים צריך ליפול בין 100 ל -300 nt עבור יישומי NGS, בעוד שהוא יכול להיות גבוה יותר (300-700 nt) עבור ניתוח ChIP-qPCR. התאמות פרוטוקול כאלה יכולות לשפר מאוד את ניתוח הכרומטין מדגימות רקמות קפואות.
מאז גילויו, הבקרה האפיגנטית בתאי יונקים זכתה להכרה הולכת וגוברת1, בהתחשב בכך שהבנת מנגנונים כאלה תספק תובנות מפתח לא רק בביולוגיה של התא, אלא גם בביולוגיה של מחלות וגידולים. יתר על כן, גורמים זיהומיים עשויים גם לגרום לשינויים אפיגנטיים של המארח2 בעוד שמנגנון התא המארח עשוי להשפיע גם על הכרומטין של פתוגנים, כגון נגיפי DNA מתמשכים 3,4. נראה כי משחק גומלין זה בין מארח לפתוגן ממלא תפקיד בהתמדה בזיהום. 2
באמצעות קשר הפיך עם דנ”א, חלבוני היסטון יוצרים קומפלקס הנקרא נוקלאוזום. נוקלאוזומים מגיעים בתורו לרמה גבוהה יותר של ארגון המכונה כרומטין. ידוע כי עיצוב מחדש של כרומטין מווסת באופן הדוק ביטוי גנים, מעניק או מונע גישה לגורמי שעתוק (TFs)5. גורמים אלה יכולים להפעיל או לחסום את גיוס ה-RNA פולימראז II (PolII) למקדמי גנים, ולהשפיע על סינתזת mRNA מתבניתהדנ“א 6. חלבוני היסטון מכילים זנבות7, משני צדי קפל ההיסטון, אשר יכולים להיות כפופים לשינויים שלאחר התרגום (PTM), המאפשרים ויסות הדוק של שעתוק הגן על ידי שינויים מבניים בכרומטין. רוב ה-PTMs של ההיסטון ממוקמים בזנב N-terminus, כאשר אצטילציה ומתילציה הן ה-PTM הנחקרות ביותר, אם כי דווח גם על זרחן8, יוביקוויטינציה9 וריבוסילציה10 . אפיון ומחקר של חלבונים כאלה הוא חיוני כדי לקבל תובנה עמוקה על בקרת גנים.
כיום, יש קומץ שיטות וכלים מבוססים היטב לחקר אינטראקציות ישירות בין דנ”א לחלבון: בדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית (EMSA), בדיקת שמרים היברידית אחת (Y1H) וטביעת רגל DNA11. עם זאת, שיטות אלה מתמקדות כשלעצמן באינטראקציות DNA-חלבון בודדות ואינן ישימות למחקרים ברחבי הגנום. מגבלה נוספת של טכניקות אלה היא היעדר קשר של היסטון עם מקטעי הדנ”א שנחקרו. לפיכך, גישות כאלה אינן אמורות לשקף את המורכבות של מנגנון השעתוק in vivo והן אינן לוקחות בחשבון שינויים מבניים חשובים12 או אנזימים/קו-פקטורים נדרשים אחרים13 שיכולים להשפיע (לקדם או לעכב) את קשירת החלבונים לדנ”א.
הרעיון שקיבוע תאים באמצעות חומרים כמו פורמלדהיד (FA) יכול לספק תמונת מצב in vivo של אינטראקציות חלבון-דנ”א, יצר את הבסיס לפיתוח מבחני משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP)14. זה, יחד עם הזמינות של טכנולוגיית PCR כמותי (qPCR) ושל נוגדנים ספציפיים מאוד, איפשר את הפיתוח של בדיקות ChIP-qPCR. לאחר מכן, הופעתן של טכניקות ריצוף מהדור הבא (NGS), שעלותן הופכת למשתלמת יותר, ויתרה על התאמת ניסויי ChIP עם גישות NGS (ChIP-seq), ובכך סיפקה לחוקרים כלים רבי עוצמה חדשים המאפשרים לחקור את ויסות הכרומטין. בבדיקות אלה, תאים מבודדים או בתרבית מקובעים עם דיסוצינימידיל גלוטרט (DSG) ו / או FA, גרעינים מבודדים, הכרומטין מקוטע ואז מואץ על ידי נוגדן העניין. לאחר מכן, DNA מטוהר ומנותח על ידי גישות PCR או NGS. בניגוד ל-EMSA, Y1H וטביעת רגל של DNA, למבחני ChIP יש את היכולת לספק תמונת מצב גלובלית של אינטראקציה חלבון-דנ”א בתוך התא. זה מציע גמישות ומאפשר ניתוח של מספר מוקדים בתוך אותו מדגם. עם זאת, בשל אופי הבדיקה, ChIP עשוי, בסופו של דבר, לזהות לא רק אינטראקציות ישירות, אלא גם אינטראקציות עקיפות, ולא להציע את הדיוק של השיטות הנ”ל, כאשר מעוניינים אינטראקציות ישירות חלבון-DNA.
פרוטוקולי הכנת כרומטין מחומר תרבית תאים מבוססים היטב15 וניתנים לשחזור רב, ומאפשרים למשתמש להשיג כרומטין המתאים הן לגישות qPCR והן לגישות NGS תוך 1-2 ימי עבודה. עם זאת, השגת כרומטין באיכות גבוהה מרקמות שלמות עדיין מהווה אתגר בגלל הצורך לנתק את התאים בתוך הרקמה תוך השגת קיבוע וגזירה אופטימליים של הכרומטין. בנוסף, ההרכב והמורפולוגיה של סוגי רקמות שונים משתנים, ולכן דורשים התאמה של פרוטוקולים קיימים16,17. השימוש ברקמה שמורה בהקפאה מציע אתגרים נוספים בהשוואה לדגימות טריות. זאת בשל הקושי להשיג השעיה של תא בודד ללא אובדן חומר נרחב. זה מוביל לגזירה לא נכונה, המעכבת יישומים במורד הזרם. עם זאת, גישה לדגימות רקמה קפואה במקום למקבילה הטרייה לא רק מגדילה את גמישות העבודה, אלא גם עשויה לייצג את האפשרות היחידה עבור חוקרים העובדים עם דגימות שמקורן במחקרי אורך או השוואה. פורסמו קומץ פרוטוקולים להכנת כרומטין לרקמות קפואות. אלה מבוססים בעיקר על הפשרת דגימות ואחריה טחינה, דיסוציאציה ידנית / מבוססת מכונה או שלבי כתישת חנקן נוזלי18,19,20.
כאן אנו מתארים שיטת הכנת כרומטיןאופטימלית 15 עבור דגימות כבד קפואות לא קבועות, המשלבת כתישת רקמות בחנקן נוזלי עם הומוגניזציה מזיקה, כדי להשיג גזירת כרומטין הניתנת לשחזור המתאימה לגישות X-ChIP שמטרתן לנתח גנום נגיפי ומארח כאחד.
הכנת כרומטין מרקמה קפואה מהירה נותרה אתגר בגלל מספר השלבים שיש לייעל על מנת להשיג תוצאות ניתנות לשחזור ואמינות. רוב הפרוטוקולים שכבר פורסמו 16,23 דורשים טחינת רקמות לפני הדיסוציאציה הידנית (douncing). ניסינו להימנע ככל האפשר מצעדים שעלולים לעורר פירוק חלבונים לפני קיבוע הדגימה. שלב הריסוק כבר נמצא בשימוש בתכשירי כבד קפואים24 והופך את הדיסוציאציה הידנית לקלה יותר וניתנת לשחזור (ראו איור 2a). עם שימוש במכתש שתוכנן במיוחד עבור צינורות 1.5 מ”ל (ראה פרוטוקולים), אובדן הדגימה במהלך תהליך הריסוק מצטמצם, ומאפשר לעבד כמויות קטנות של רקמה כגון דגימות ביופסיה של הכבד. באופן עקרוני ניתן להשתמש בהומוגניזציה ישירה של רקמות ללא כל שלבי שחיקה; עם זאת, הומוגניזציה של רקמות ללא כתישה קודמת יש שחזור גרוע יותר בניסיון שלנו ואת המראה של בעיות עבור יישומים במורד הזרם היה גבוה יותר (הנתונים לא מוצגים).
רוב הבעיות בהן נתקלים בהכנת כרומטין מרקמות נובעות מאופי הדגימות הללו ומחוסר היכולת לבדוק כראוי אם אשכולות התאים קטנים מספיק לקיבוע מבלי לאבד מאיכותם. יתר על כן, בדיקת כל aliquot בכל שלב יהיה זמן רב להגדיל את הסיכוי של פירוק חלבון.
קיבוע (שלב 3.9) הוא חלק בסיסי ומכריע בהכנת הכרומטין. בשל אופי הרקמה, שלב הקיבוע התעכב עד להומוגניזציה של הרקמה. לשלב קיבוע נדחה כזה יש יתרון לייצר השעיית תאים הומוגנית יותר. עם זאת, אנו מכירים בכך שבמקרה של מטרות רגישות במיוחד למניפולציה, ייתכן שיהיה צורך לבצע את הקיבוע ממש לפני שלב 3.6. זה יעזור להגן על חלבונים רגישים מאוד או PTM, אם כי זה עשוי להגדיל את גודל אשכולות התא, כי כאשר קבוע עלול לגרום לגזירה לא הומוגנית. הריכוז של תמיסת FA המשמשת בפרוטוקול הוא סטנדרטי, עם זאת, ניתן לשנות אותו כדי לנסות לשפר את הקיבוע הכולל. זמן הקיבוע שנבחר כאן משקף גם תנאים סטנדרטיים הנפוצים בתחום. במקרה של ריכוז גבוה יותר של תמיסת הקיבוע, זמן הקיבוע עשוי להיות מופחת, ואילו במקרה של כמות נמוכה יותר יש להגדיל אותו. על המפעיל לקחת בחשבון כי שינוי זמן הקיבוע עלול להוביל לקיבוע יתר של הדגימה או לתת מקום לפירוק חלבון. במקרה של שאיפה לזרז קומפלקסים גדולים (או חלק מהם) ו- TFs, יהיה זה יתרון לבצע קיבוע דו-שלבי באמצעות פתרון DSG ואחריו FA אחד25,26. DSG במקרה זה ייצב אינטראקציות חלבון-חלבון, בעוד פורמלדהיד פועל בעיקר על אינטראקציות DNA-חלבון ישירות27.
על המפעיל לקחת בחשבון את האפשרות ליישם ערכה מבוססת עמודות לטיהור DNA החל משלב 6.7 שהוא מהיר יותר ואינו משתמש בתרכובות רעילות. עם זאת, תמיד תהיה כמות מסוימת של דנ”א לא קשור שיאבד. מסיבה זו, אנו ממליצים להשתמש במיצוי פנול-כלורופורם קלאסי ואחריו משקעים EtOH. יתר על כן, לפני הפעלת ג’ל אגרוז (שלב 7.2) זה יכול להיות מועיל למדוד את ריכוז ה- DNA ולטעון את אותה כמות עבור כל באר כדי לקבל תמונה ברורה יותר.
מגבלה של פרוטוקול זה נובעת מהעובדה שחקרנו והשתמשנו בפרוטוקול זה רק באמצעות דגימות כבד שמקורן בעכברים כימריים אנושיים-כבדים28. כשלעצמו הכבד מורכב מרקמת אפיתל וחיבור29. במקרה של מחלה, רקמה פיברוטית ורקמת שומן עשויים להיות נוכחים30,31 יצירת אתגרים נוספים במהלך הפרעה ברקמות. עם זאת, אנו מכירים בכך שלא ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו על רקמת עצם, שריר ושומן ללא אופטימיזציה של שלבי הדיסוציאציה והסוניקציה. יש לציין כי כל רקמה דורשת אופטימיזציה כלשהי בשל היעדר פרוטוקול המתאים לכולם כמו לדגימות תרבית תאים15. אנו מאמינים, עם זאת, כי עם אופטימיזציה מועטה או ללא אופטימיזציה כלל, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בהצלחה על רקמות אחרות החולקות דמיון עם הכבד בהרכב, כמו ריאות, מעי, קיבה, לבלב או רקמות כליות.
הפרוטוקול שלנו שימש בהצלחה גם לניתוח TFs ושינויים בהיסטון על אפיזום DNA סגור קוולנטית HBV (cccDNA)32. זה פותח את ההזדמנות ליישם גישה כזו עבור גנומים נגיפיים אחרים המשפיעים על הכבד, כגון Cytomegalovirus33 אנושי (hCMV) ו Adenoviruses34 אנושי (HAdV). זה לא נכלל כי ניתן יהיה לנתח וירוסים אחרים DNA להקים זיהום מתמשך ברקמות אחרות כמו Kaposi Sarcoma הרפס וירוס35 (KHSV), הרפס סימפלקס וירוס 36 (HSV1/2) וירוסים פוליומה, וירוס אפשטיין-בר37 (EBV).
The authors have nothing to disclose.
המחקר נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG) על ידי מענק למאורה דנדרי (SFB 841 A5) ועל ידי מדינת המבורג עם תוכנית המחקר (LFF-FV44: EPILOG).
ברצוננו להודות לד”ר טאסילו וולץ, איבון לאדיג’ס ואניקה וולמרי על העזרה הטכנית ועל הקריאה הביקורתית של כתב היד. ד”ר תומאס גינתר ופרופ’ אדם גרונדהוף על מתן הצעות מועילות מאוד וערכות הפריימר לניתוח ChIP-qPCR.
0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Bioruptor NGS | Diagenode | ||
Blade or Scalpel | |||
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
Glycin | Carl Roth | 0079 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
Heating block | |||
HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
LE Agarose | Biozym | 840000 | |
Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
NP-40 | Roche | 11332473001 | |
PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
Phase Lock Gel – Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |