该协议侧重于从快速冷冻组织中制备染色质,适用于交联染色质免疫沉淀(X-ChIP),然后进行定量PCR分析(X-ChIP-qPCR)或下一代测序方法(X-ChIP-seq)。
交联染色质免疫沉淀 (X-ChIP) 是一种广泛使用的技术,用于评估组蛋白标记水平和宿主和/或病原体染色质上转录因子的占用率。从组织中制备染色质带来了额外的挑战,需要克服这些挑战才能获得与细胞培养方案相当的可重复且可靠的方案。组织破碎和固定是实现染色质有效剪切的关键步骤。不同细胞类型和簇的共存也可能需要不同的剪切时间才能达到最佳片段大小并阻碍剪切重现性。该方法的目的是从适用于 ChIP-qPCR 和下一代测序 (NGS) 应用的冷冻组织(肝脏)中获得可靠且可重现的宿主染色质制备。我们观察到,与仅匀浆相比,液氮组织粉碎和均质化的组合导致可提高重现性,因为它提供了主要由可以有效剪切的解离单细胞组成的悬浮液。此外,固定步骤应在温和旋转下进行,以提供均匀的交联。然后,固定材料适用于基于缓冲液的细胞核分离,以减少细胞质蛋白和病原体DNA和RNA(如果适用)的污染,避免耗时的离心梯度。随后的超声处理将完成核溶解并剪切染色质,根据所选的剪切条件产生特定的尺寸范围。对于 NGS 应用,尺寸范围应在 100 到 300 nt 之间,而对于 ChIP-qPCR 分析,尺寸范围可能更高 (300-700 nt)。这种方案调整可以极大地改善冷冻组织标本的染色质分析。
自发现以来,哺乳动物细胞中的表观遗传调控已获得越来越多的认可1,考虑到对这些机制的理解不仅将在细胞生物学中提供关键见解,而且将在疾病和肿瘤生物学中提供关键见解。此外,感染因子也可能引起宿主表观遗传变化2 ,而宿主细胞机制也可能影响病原体的染色质,例如持续存在的DNA病毒3,4。这种宿主-病原体相互作用似乎在感染持续性中发挥作用。阿拉伯数字
通过与DNA的可逆结合,组蛋白形成一种称为核小体的复合物。核小体依次达到称为染色质的更高层次的组织。众所周知,染色质重塑会严格调节基因表达,授予或拒绝获取转录因子(TF)5。这些因素可以触发或阻止RNA聚合酶II(PolII)募集到基因启动子上,从而影响DNA模板的mRNA合成6。组蛋白含有尾巴7,位于组蛋白折叠的两端,可以受到翻译后修饰(PTM),允许通过结构染色质变化严格调节基因转录。大多数组蛋白PTM位于尾部N末端,乙酰化和甲基化是研究得最好的PTM,尽管磷酸化8,泛素化9 和核糖基化10 也有报道。因此,表征和研究这些蛋白质对于深入了解基因调控至关重要。
目前,有一些成熟的方法和工具可用于研究直接的DNA-蛋白质相互作用:电泳迁移率转移测定(EMSA),酵母单杂交测定(Y1H)和DNA足迹11。然而,这些方法 本身 侧重于单个DNA-蛋白质相互作用,不适用于全基因组研究。这些技术的另一个局限性是缺乏组蛋白与所研究的DNA片段的关联。因此,这些方法并不意味着反映 体内 转录机制的复杂性,并且它们没有考虑可能影响(促进或抑制)蛋白质与DNA结合的重要结构变化12 或其他必需的酶/辅因子13 。
用甲醛(FA)等试剂固定细胞可以提供蛋白质-DNA相互作用的 体内 快照的想法,为染色质免疫沉淀测定(ChIP)的发展奠定了基础14。这一点,再加上定量 PCR (qPCR) 技术和高度特异性抗体的可用性,使 ChIP-qPCR 检测得以开发。随后,成本越来越实惠的下一代测序技术 (NGS) 的出现,将 ChIP 实验与 NGS 方法 (ChIP-seq) 相结合,从而为研究人员提供了新的强大工具,能够研究染色质调控。在这些测定中,用戊二酸二琥珀酰亚胺酯(DSG)和/或FA固定分离或培养的细胞,分离细胞核,然后染色质被目标抗体片段化和沉淀。此后,通过PCR或NGS方法纯化和分析DNA。与 EMSA、Y1H 和 DNA 足迹相比,ChIP 检测能够提供细胞内蛋白质-DNA 相互作用的全局快照。这提供了灵活性,并允许分析同一样品中的多个位点。然而,由于测定的性质,当对直接蛋白质-DNA 相互作用感兴趣时,ChIP 最终不仅可以检测直接相互作用,还可以检测间接相互作用,无法提供上述方法的精度。
来自细胞培养材料的染色质制备方案是成熟的15并且高度可重复,允许用户在1-2个工作日内获得适用于qPCR和NGS方法的染色质。然而,从整个组织获得高质量的染色质仍然是一个挑战,因为需要在实现染色质的最佳固定和剪切的同时解离组织内的细胞。此外,不同类型组织的组成和形态各不相同,因此需要调整现有的方案16,17。与新鲜样品相比,使用冷冻保存的组织带来了额外的挑战。这是由于难以在不造成大量材料损失的情况下获得单细胞悬液。这会导致剪切不当,阻碍下游应用。尽管如此,使用冷冻组织标本而不是新鲜标本不仅增加了工作灵活性,而且还可能是研究人员使用来自纵向或比较研究的标本的唯一选择。已经发表了一些用于冷冻组织的染色质制备方案。这些主要基于样品解冻,然后切碎,手动/机器解离或液氮粉碎步骤18,19,20。
在这里,我们描述了一种用于冷冻未固定肝脏标本的优化染色质制备方法15 ,该方法将液氮中的组织粉碎与杵均质化相结合,以实现适用于X-ChIP方法的可重复染色质剪切,旨在分析病毒和宿主基因组。
从快速冷冻组织制备染色质仍然是一个挑战,因为需要优化许多步骤才能获得可重复和可靠的结果。大多数已经发表的方案16,23 要求在手动解离(扩增)之前切碎组织。我们尽量避免在固定样品之前可能引起蛋白质降解的步骤。粉碎步骤已经用于冷冻肝脏制剂24 ,并且使手动解离更容易且可重复(见 图2a)。通过使用专为 1.5 mL 管设计的研钵(参见协议),粉碎过程中的标本损失减少,允许处理少量组织,例如肝活检标本。原则上,可以使用直接组织均质化,而无需任何研磨步骤;然而,根据我们的经验,没有先前粉碎的组织均质化具有较差的重现性,并且下游应用出现问题的出现更高(数据未显示)。
从组织中制备染色质时遇到的大多数问题源于这些样品的性质以及无法正确检查细胞簇是否足够小以进行固定而不会降低质量。此外,在每个步骤中检查每个等分试样将非常耗时,从而增加蛋白质降解的机会。
固定(步骤3.9)是染色质制备的基本和关键部分。由于组织的性质,固定步骤被推迟到组织均质化。这种推迟的固定步骤的优点是产生更均匀的细胞悬液。但是,我们认识到,对于特别对操作敏感的目标,可能需要在步骤3.6之前执行固定。这将有助于保护极其敏感的蛋白质或PTM,尽管它可能会增加细胞簇的大小,但当固定时可能导致非均匀剪切。协议中使用的FA溶液的浓度是标准的,但是,可以对其进行修改以尝试改善整体固定。这里选择的注视时间也反映了现场常用的标准条件。在固定溶液浓度较高的情况下,固定时间可以减少,而在较低量的情况下,应增加固定时间。操作人员应考虑固定时间的改变可能导致样品过度固定或为蛋白质降解留出空间。如果旨在沉淀大复合物(或其的一部分)和TF,则使用DSG溶液进行双步固定,然后使用FA溶液进行双步固定25,26将是有利的。在这种情况下,DSG将稳定蛋白质 – 蛋白质相互作用,而甲醛主要作用于直接的DNA-蛋白质相互作用27。
操作人员应考虑从步骤6.7开始实施基于柱的DNA纯化试剂盒的可能性,该试剂盒速度更快且不使用有毒化合物。然而,总会有一定数量的未结合的DNA丢失。因此,我们建议使用经典的苯酚-氯仿萃取,然后使用EtOH沉淀。此外,在运行琼脂糖凝胶(步骤7.2)之前,测量DNA浓度并为每个孔加载相同的量以获得更清晰的图像可能是有益的。
该协议的局限性源于我们仅使用来自人肝嵌合小鼠的肝脏标本探索和利用该协议28。肝脏本身由上皮和结缔组织组成29.在疾病的情况下,可能存在纤维化组织和脂肪组织30,31 ,在组织破坏过程中产生额外的挑战。然而,我们认识到,如果不优化解离和超声处理步骤,我们的方案可能无法用于骨骼、肌肉和脂肪组织。需要注意的是,由于缺乏适合所有组织的方案,例如细胞培养样品15,因此每种组织都需要进行某种优化。然而,我们相信,通过很少或根本没有优化,该协议可以成功地应用于与肝脏成分相似的其他组织,如肺,肠,胃,胰腺或肾组织。
我们的协议也已成功用于分析HBV共价闭合DNA表观体(cccDNA)上的TF和组蛋白修饰32。这为将这种方法应用于影响肝脏的其他病毒基因组(如人类巨细胞病毒33(hCMV)和人类腺病毒34(HAdV))提供了机会。不排除有可能分析在其他组织中建立持续感染的其他 DNA 病毒,如卡波西肉瘤疱疹病毒35 (KHSV)、单纯疱疹病毒 36 (HSV1/2) 多瘤病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒37 (EBV)。
The authors have nothing to disclose.
该研究得到了德国研究基金会(DFG)对Maura Dandri(SFB 841 A5)和汉堡州研究计划(LFF-FV44:EPILOG)的支持。
我们要感谢Tassilo Volz博士,Yvonne Ladiges和Annika Volmari的技术帮助和批判性地阅读手稿。Thomas Günther博士和Adam Grundhoff教授为ChIP-qPCR分析提供了非常有用的建议和引物集。
0.22µm sterile syringe filter | Labsolute | 7699822 | |
1.5 mL Safeseal tubes | Sarstedt | 7,27,06,400 | |
6x orange loading dye | Thermofisher | R0631 | |
Benchtop refrigerated centrifuge | |||
Bioruptor NGS | Diagenode | ||
Blade or Scalpel | |||
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | HN04 | |
Chloroform | Sigma Aldrich (Merck) | C2432 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
Deacetylase Inhibitor | Active Motif | 37494 | |
Dounce tissue grinder set | Sigma Aldrich (Merck) | DWK885300-0001-1EA | |
EDTA 500 mM solution | PanReac AppliChem | A4892 | |
EGTA | Sigma Aldrich (Merck) | E4378 | |
EtBr | Carl Roth | 2218 | Concentration 10mg/mL |
Ethanol absolute | CHEMSOLUTE | 2273 | |
Glycerol | Sigma Aldrich (Merck) | G9012 | |
Glycin | Carl Roth | 0079 | |
Glycogen | Roche | 10901393001 | Concentration: 20mg/mL |
Heating block | |||
HEPES | Sigma Aldrich (Merck) | H4034 | |
LE Agarose | Biozym | 840000 | |
Liquid nitrogen cooled mini mortar | Bel-Art | H37260-0100 | |
MeOH free Formaldehyde 16% | Thermofisher | 28908 | |
NP-40 | Roche | 11332473001 | |
PBS 1x | Thermofisher | 10010015 | |
Pefabloc SC-Protease-Inhibitor | Sigma Aldrich (Merck) | 11429868001 | |
Phase Lock Gel – Heavy | QuantaBio | 2302830 | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol 25:24:1 | Sigma Aldrich (Merck) | P3803 | |
Potassium chloride | Carl Roth | 6781 | |
Potassium hydroxyde | Merck | 105033 | |
Proteinase K | Lucigen | MPRK092 | Concentration: 50 µg/µL |
RNAse A | Lucigen | MRNA092 | Concentration: 5 mg/mL |
SDS 10% solution | PanReac AppliChem | A3950 | |
Sodium carbonate anhydrous | Carl Roth | A135 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich (Merck) | S7653 | |
Sterile Petri dishes | Sarstedt | 83,39,02,500 | |
Tris-HCl solution | Sigma Aldrich (Merck) | T2694 | |
Triton-X100 | Sigma Aldrich (Merck) | X100 |