Brug af E1A Minigene Tool til at studere mRNA-splejsningsændringer
Summary
Denne protokol præsenterer et hurtigt og nyttigt værktøj til evaluering af et proteins rolle med ukarakteriseret funktion i alternativ splejsningsregulering efter kemoterapeutisk behandling.
Abstract
mRNA-behandling involverer flere samtidige trin til at forberede mRNA til oversættelse, såsom 5’udjævning, poly-A-tilsætning og splejsning. Udover konstituerende splejsning giver alternativ mRNA-splejsning mulighed for at udtrykke multifunktionelle proteiner fra et gen. Da interactome-undersøgelser generelt er den første analyse af nye eller ukendte proteiner, er foreningen af agnproteinet med splejsningsfaktorer et tegn på, at det kan deltage i mRNA-splejsningsproces, men at bestemme, i hvilken sammenhæng eller hvilke gener der reguleres, er en empirisk proces. Et godt udgangspunkt for at evaluere denne funktion er at bruge det klassiske minigene værktøj. Her præsenterer vi adenoviral E1A minigene brug for evaluering af alternative splejsning ændringer efter forskellige cellulære stress stimuli. Vi vurderede splejsning af E1A minigene i HEK293 stably overexpressing Nek4 protein efter forskellige stressende behandlinger. Protokollen omfatter E1A minigentransfekt, cellebehandling, RNA-ekstraktion og cDNA-syntese efterfulgt af PCR- og gelanalyse og kvantificering af E1A-splejsede varianter. Brugen af denne enkle og veletablerede metode kombineret med specifikke behandlinger er et pålideligt udgangspunkt for at kaste lys over cellulære processer, eller hvilke gener der kan reguleres af mRNA-splejsning.
Introduction
Splejsning er blandt de vigtigste trin i eukaryote mRNA-behandling, der sker samtidigt til 5’mRNA-udjævning og 3’mRNA polyadenylering, bestående af intronfjernelse efterfulgt af exon-krydset. Det splejsningssteders (SS) anerkendelse af splejsningsstederne, et ribonukleoproteinkompleks, der indeholder små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 og U6), små RNA’er (snRNA’er) og flere regulerende proteiner1 er nødvendige for splejsning.
Ud over intronfjernelse (konstituerende splejsning) kan introner i eukaryoter bevares, og exoner kan udelukkes, hvilket konfigurerer processen kaldet mRNA-alternativ splejsning (AS). Den alternative præ-mRNA splejsning udvider kodning kapacitet eukaryote genomer gør det muligt at producere et stort og forskelligartet antal proteiner fra et relativt lille antal gener. Det anslås , at 95-100% af humane mRNA’er , der indeholder mere end én exon , kan gennemgå alternativ splejsning2,3. Dette er grundlæggende for biologiske processer som neuronal udvikling, apoptoseaktivering og cellulær stressrespons4, der giver organismens alternativer til at regulere cellefunktion ved hjælp af det samme repertoire af gener.
De maskiner, der er nødvendige for alternativ splejsning, er de samme, der anvendes til konstituerende splejsning, og brugen af SS er den vigtigste afgørende faktor for alternativ splejsning. Konstituerende splejsning er relateret til brugen af stærke splejsningssteder, som normalt mere ligner konsensusmotiver til splejsning afanerkendelse 5.
Alternative exons er typisk anerkendt mindre effektivt end konstituerende exons når dens cis-regulerendeelementer, sekvenserne i 5’SS og 3’SS flankerende disse exons, viser en ringere bindende kapacitet til splejsning. mRNA indeholder også regioner med navnet forstærkere eller lyddæmpere beliggende i exons (exonic splejsning forstærkere (ESEs) og exonic splejsning lyddæmpere (ESSs)) og introner (intronic splejsning forstærkere (ISEs) og intronic splejsning lyddæmpere (ISSs)), der forbedrer eller undertrykke exon brug, henholdsvis5. Disse sekvenser genkendes af transregulerende elementer eller splejsningsfaktorer (SF). SF’er repræsenteres hovedsageligt af to proteinfamilier, de serin-/argininrige splejsningsfaktorer (SRSF’er), der binder sig til EES og familien af heterogene nukleare ribonukleoproteiner (hnRNP’er), som binder sig til ESS-sekvenser5.
Alternativ splejsning kan moduleres ved fosforylering/ dephosphorylering af transfaktorer , der ændrer interaktionspartnerne , og cellulær lokalisering af splejsningsfaktorer6,7,8. Identifikation af nye regulatorer af splejsningsfaktorer kan give nye værktøjer til at regulere splejsning og dermed nogle kræftbehandlinger.
Anufrieva et al.9observerede i en mRNA-mikroarray-genekspressionsprofil konsekvente ændringer i niveauer af splejseosomale komponenter i 101 cellelinjer og efter forskellige stressforhold (platinbaserede lægemidler, gammabestråling, topoisomerase-hæmmere, tyrosinkinasehæmmere og taxanes). Forholdet mellem splejsning mønster og kemoterapi effekt er allerede blevet påvist i lungekræft celler, som er kemoterapi resistente, viser ændringer i caspase-9 varianter sats10. HEK293 celler behandlet med kemoterapeutiske panel viser ændringer i splejsning med en stigning i pro-apptotiske varianter. Gabriel et al.11 observerede ændringer i mindst 700 tilfælde af splejsning efter cisplatinbehandling i forskellige cellelinjer og påpegede, at splejsningsveje er cisplatin-påvirket. Splejsning modulatorer har allerede vist anti-tumoral aktivitet, viser, at splejsning er vigtigt at tumoral udvikling og, hovedsagelig, kemoterapi respons12. Derfor er det meget vigtigt at karakterisere nye proteiner, der regulerer splejsning efter cellulære stressfaktorer, som kemoterapeutik, for at opdage nye behandlingsstrategier.
Ledetrådene i alternativ splejsning regulering fra interactome undersøgelser, især vigtigt at karakterisere funktioner af nye eller ukarakteriserede proteiner, kan kræve en mere generel og enkel tilgang til at kontrollere den reelle rolle protein i AS. Minigener er vigtige værktøjer til analyse af den generelle rolle af et protein, der påvirker splejsning regulering. De indeholder segmenter af interessegen, der indeholder alternativt splejsede og flankerende genomiske regioner13. Ved hjælp af et minigenværktøj kan analysen af splejsning in vivo med flere fordele såsom længden af minigenet, som er mindre og derfor ikke er en begrænsning af forstærkningsreaktionen; den samme minigen kan evalueres i forskellige cellelinjer; alle cellulære komponenter, hovedsagelig deres regulerende post-translationelle modifikation (fosforylering og ændringer i cellerum) er til stede og kan behandles13,14. Desuden kan ændringer i alternativt splejsningsmønster observeres efter cellulær stress, og brugen af et minigensystem gør det muligt at identificere den vej, der moduleres af forskellige stimuli.
Der er flere minigene systemer, der allerede er beskrevet, som er specifikke for forskellige former for splejsning begivenheder13,14, men som en foreløbig analyse, minigene E1A15 er en meget veletableret alternativ splejsning reporter system til undersøgelse af 5’s SS udvælgelse in vivo. Fra kun ét gen, E1A, fem mRNA’er er produceret af alternative splejsning baseret på udvælgelse af tre forskellige 5 ‘splejsning steder og en større eller en mindre 3 ‘splejsning site16,17,18. Udtrykket af E1A varianter ændres i henhold til perioden for Adenoviral infektion19,20.
Vi har tidligere vist, at både Nek4 isoformer interagerer med splejsningsfaktorer som SRSF1 og hnRNPA1, og mens isoform 2 ændrer minigen E1A alternativ splejsning, har isoform 1 ingen effekt i den21. Fordi isoform 1 er den mest rigelige isoform og ændrer kemoterapiresistens og DNA-skaderespons, vurderer vi, om det kan ændre minigen E1A alternativ splejsning i en stresstilstand.
Minigene assay er en enkel, billig og hurtig metode, da den kun har brug for RNA-ekstraktion, cDNA-syntese, forstærkning og agarosegelanalyser og kan være et nyttigt værktøj til at evaluere, da en mulig effekt på alternativ splejsning af et protein af interesser indtil virkningen af forskellige behandlinger på cellulært alternativt splejsningsmønster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigener er vigtige værktøjer til at bestemme virkningerne i den globale alternative splejsning in vivo. Den adenoviral minigene E1A er blevet brugt med succes i årtier til at evaluere proteiners rolle ved at øge mængden af disse i celle13,14. Her foreslår vi minigene E1A brug til evaluering af alternativ splejsning efter kemoterapieksponering. En stabil cellelinje, der udtrykker Nek4 isoform 1, blev brugt, så man undgik artefakter af overekspression for?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, gennem Grant Temático 2017/03489-1 til JK og stipendium til FLB 2018/05350-3) og Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) til finansiering af denne forskning. Vi vil gerne takke Dr. Adrian Krainer for at give pMTE1A plasmid og Zerler og kolleger for deres arbejde i E1A kloning. Vi takker også prof. Dr. Patrícia Moriel, prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, prof. Dr. Marcelo Lancellotti og prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller for at give os mulighed for at bruge deres laboratorieplads og udstyr.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
