שימוש בכלי המיני-דג'ן E1A לחקר שינויי ההסתבכות של mRNA
Summary
פרוטוקול זה מציג כלי מהיר ושימושי להערכת תפקידו של חלבון עם פונקציה לא אופיינית בוויסות חיבור חלופי לאחר טיפול כימותרפי.
Abstract
עיבוד mRNA כרוך במספר שלבים בו-זמניים להכנת mRNA לתרגום, כגון 5’capping, תוספת פולי-A וחביך. מלבד חיבור מהווה, חיבור mRNA חלופי מאפשר ביטוי של חלבונים רב תכליתיים מגן אחד. כמו מחקרים interactome הם בדרך כלל הניתוח הראשון עבור חלבונים חדשים או לא ידועים, הקשר של חלבון הפיתיון עם גורמי חיבור הוא אינדיקציה כי זה יכול להשתתף בתהליך חיבור mRNA, אבל כדי לקבוע באיזה הקשר או מה הגנים מוסדר הוא תהליך אמפירי. נקודת התחלה טובה להערכת פונקציה זו היא באמצעות כלי מיני-דג’ן קלאסי. כאן אנו מציגים את השימוש במיני-ז’נים E1A אדנו-ויראלי להערכת שינויי ההצמדה החלופיים לאחר גירויי לחץ תאיים שונים. הערכנו את ההשתתפות של מיני-דגן E1A ב- HEK293 המבטא יתר על המידה חלבון Nek4 לאחר טיפולי הדגמה שונים. הפרוטוקול כולל E1A מיני-דבק, טיפול בתא, מיצוי RNA וסינתזת cDNA, ואחריו ניתוח PCR וג’ל וכימות של גרסאות משולבות E1A. השימוש בשיטה פשוטה ומבוססת זו בשילוב עם טיפולים ספציפיים הוא נקודת התחלה אמינה לשפוך אור על תהליכים תאיים או אילו גנים ניתן להסדיר על ידי חבית mRNA.
Introduction
חיבור הוא בין השלבים החשובים ביותר בעיבוד mRNA אאוקריוטי המתרחש בו זמנית ל- 5’mRNA המכסה ופוליאדנילציה של 3’mRNA, המורכבת מהסרת אינטרונים ואחריה צומת אקסון. ההכרה של אתרי splicing (SS) על ידי spliceosome, קומפלקס ריבונוקליאופרוטאין המכיל ריבונוקלאופרוטאינים קטנים (snRNP U1, U2, U4 ו- U6), RNAs קטנים (snRNAs) וכמה חלבוניםרגולטוריים 1 יש צורך splicing.
מלבד הסרה אינטרון (splicing מרכיב), ב eukaryotes, introns ניתן לשמור ו exons ניתן לשלול, קביעת התצורה של התהליך שנקרא splicing חלופי mRNA (AS). ההשתתפות החלופית לפני ה-mRNA מרחיבה את יכולת הקידוד של הגנום האוקריוטי המאפשר ייצור של מספר גדול ומגוון של חלבונים ממספר קטן יחסית של גנים. ההערכה היא כי 95-100% של mRNAs אנושי המכילים יותר מאקון אחד יכול לעבור splicingחלופי 2,3. זה בסיסי עבור תהליכים ביולוגיים כמו התפתחות עצבית, הפעלת אפופטוזיס ותגובת מתח תאי 4 , מתןחלופותהאורגניזם לווסת את תפקוד התא באמצעות אותו רפרטואר של גנים.
המכונות הדרושות לחבורת אלטרנטיבית זהה לשימוש בהשתלבתיות מכוננת והשימוש ב- SS הוא הקובע העיקרי להתרחשות פריצה חלופית. חלוקה מכוננת קשורה לשימוש באתרי חלוקה חזקים, הדומים בדרך כלל יותר למוזגי קונצנזוס להכרה5.
אקסונים אלטרנטיביים מוכרים בדרך כלל פחות ביעילות מאשר אקסונים מכוננים ברגע שהרכיבים הרגולטוריים של cis,הרצפים ב- 5 SS ו- 3’sS מאגפים את האקסונים האלה, מראים יכולת מחייבת נחותה לתרסיס. mRNA מכיל גם אזורים בשם משפרי או משתיקי קול הממוקמים אקסונים (משפרי ESEs) ו- splicing exonic (ESSs)) ואינטרונים (משפרי חוג אינטרוניים (ISEs) ומשתיקים אינטרוניים של שכפול (ISSs)) המשפרים או מדחיקים את השימוש ב- exon, בהתאמה5. רצפים אלה מזוהים על ידי אלמנטים טרנס-רגולטוריים, או גורמי שיתוף (SF). SFs מיוצגים בעיקר על ידי שתי משפחות של חלבונים, גורמי הצמדה עשירים serine / ארגינין (SRSFs) אשר נקשרים ESEs ואת המשפחה של ריבונוקלאופרוטאינים גרעיניים הטרוגניים (hnRNPs) אשר נקשרים רצפי ESSs5.
שכפול חלופי יכול להיות מווסת על ידי זרחן / dephosphorylation של טרנס – גורמים המשנים את השותפים אינטראקציות ולוקליזציה הסלולר של גורמי splicing6,7,8. זיהוי רגולטורים חדשים של גורמי שכפול יכול לספק כלים חדשים כדי לווסת את ההסתבכות, וכתוצאה מכך, כמה טיפולים בסרטן.
Anufrieva ואח‘9, בפרופיל ביטוי גן microarray mRNA, נצפו שינויים עקביים ברמות של רכיבים spliceosomal ב 101 קווי תאים ולאחר תנאי לחץ שונים (תרופות מבוססות פלטינה, הקרנת גמא, מעכבי topoisomerase, מעכבי טירוסין קינאז ומסים). הקשר בין דפוס ההשתלשלות ויעילות הכימותרפיה כבר הוכח בתאי סרטן ריאות, שהם עמידים לכימותרפיה, ומציגים שינויים בגרסאות caspase-9 שיעור10. HEK293 תאים שטופלו עם לוח כימותרפיה להראות שינויים splicing עם עלייה בגרסאות פרו-אפופטוטי. גבריאל ואח‘ 11 נצפו שינויים לפחות 700 אירועים של splicing לאחר טיפול ציספלטין בשורות תאים שונים, וציין כי נתיבי שיוך מושפעים ציספלטין. מאפננים splicing כבר הוכיחו פעילות אנטי גידולית, מראה כי splicing חשוב להתפתחות הגידול, ובעיקר,תגובה כימותרפית 12. לפיכך, אפיון חלבונים חדשים המסדירים את ההשתתפות לאחר סוכני לחצים תאיים, כמו כימותרפיה, חשוב מאוד לגלות אסטרטגיות חדשות של טיפול.
הרמזים של ויסות שכפול אלטרנטיבי ממחקרים interactome, חשוב במיוחד לאפיין פונקציות של חלבונים חדשים או לא אופייניים, יכול לדרוש גישה כללית ופשוטה יותר כדי לאמת את התפקיד האמיתי של החלבון ב- AS. מיני-ג’נס הם כלים חשובים לניתוח התפקיד הכללי של חלבון המשפיע על ויסות ההשתתפות. הם מכילים קטעים מתוך גן של עניין המכיל לחילופין אזורים גנומיים מסונפים ולאגפים13. שימוש בכלי מיני-דג’ן מאפשר ניתוח של חוג ב- vivo עם מספר יתרונות כגון אורך המיניג’ן שהוא מינורי ולכן אינו מגבלה לתגובת ההגברה; ניתן להעריך את אותו מיני-דגן בשורות תאים שונים; כל הרכיבים התאיים, בעיקר שינוי לאחר התרגום שלהם (זרחן ושינויים בתאי התא) נמצאים וניתן לטפל בהם13,14. יתר על כן, שינויים דפוס splicing חלופי ניתן לראות לאחר מתח הסלולר, השימוש במערכת מיני-ז’ן, לאפשר לזהות את המסלול להיות מווסת על ידי גירויים שונים.
ישנן מספר מערכות מיני-דג’ן שכבר תוארו הספציפיות לסוגים שונים של אירועי חיתור13,14, עם זאת, כבדיקה ראשונית, המיני-ג’ין E1A15 היא מערכת כתבים חלופית מבוססת מאוד לחקר בחירת ה- SS של 5 ב- vivo. מתוך גן אחד בלבד, E1A, חמישה mRNAs מיוצרים על ידי חיבור חלופי המבוסס על בחירה של שלושה אתרי חיבור שונים 5 ′ ושל אחד גדול או אחד קטן 3 ′ splice אתר16,17,18. הביטוי של גרסאות E1A משתנה בהתאם לתקופה של זיהום אדנו-ויראלי19,20.
הראינו בעבר כי שני isoforms Nek4 אינטראקציה עם גורמי splicing כגון SRSF1 ו hnRNPA1 ובעוד isoform 2 משנה מיני-סוגן E1A חלופי, isoform 1 אין השפעה עלזה 21. מכיוון ש- isoform 1 הוא האיזופורם הנפוץ ביותר ומשנה עמידות לכימותרפיה ותגובת נזק לדנ”א, אנו מעריכים אם הוא יכול לשנות חוג חלופי של Minigene E1A במצב לחץ.
מיניג’ן אסאי היא שיטה פשוטה, בעלות נמוכה ומהירה, שכן היא זקוקה רק לחילוץ RNA, סינתזת cDNA, הגברה וניתוחי ג’ל אגרוז, ויכולה להיות כלי שימושי להערכה מאז השפעה אפשרית על חוג חלופי על ידי חלבון של תחומי עניין עד ההשפעה של טיפולים שונים על דפוס splicing חלופי הסלולר.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיני-ג’נס הם כלים חשובים לקביעת ההשפעות של תרסיסים אלטרנטיביים גלובליים ב-vivo. ה adenoviral minigene E1A שימש בהצלחה במשך עשרות שנים כדי להעריך את התפקיד של חלבונים על ידי הגדלת כמות אלה בתא13,14. כאן, אנו מציעים את השימוש E1A minigene להערכת חוג חלופי לאחר חשיפה כימותרפית. קו ת?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, דרך גרנט Temático 2017/03489-1 ל- JK ואחווה ל FLB 2018/05350-3) ולקונסטליונל דה Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) למימון מחקר זה. ברצוננו להודות לד”ר אדריאן קריינר על שסיפק את pMTE1A פלסמיד וזלר ועמיתיו על עבודתם בשיבוט E1A. אנו מודים גם לפרופ’ ד”ר פטרישיה מוריאל, לפרופ’ ד”ר וונדה פריירה אלמידה, לפרופ’ מרסלו לנסלוטי ולפרופ’ ד”ר קרינה קוגו קוגו מולר על כך שיאפשרו לנו להשתמש בשטח המעבדה ובציוד שלהם.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
