Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA
Summary
Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.
Abstract
L’elaborazione dell’mRNA prevede più passaggi simultanei per preparare l’mRNA per la traduzione, come 5’capping, aggiunta poli-A e splicing. Oltre allo splicing costitutivo, lo splicing alternativo dell’mRNA consente l’espressione di proteine multifunzionali da un unico gene. Poiché gli studi interactome sono generalmente la prima analisi per proteine nuove o sconosciute, l’associazione della proteina esca con fattori di splicing è un’indicazione che può partecipare al processo di splicing dell’mRNA, ma determinare in quale contesto o quali geni sono regolati è un processo empirico. Un buon punto di partenza per valutare questa funzione è l’utilizzo dello strumento minigene classico. Qui presentiamo l’uso del minigene Adenovirale E1A per valutare i cambiamenti di splicing alternativi dopo diversi stimoli di stress cellulare. Abbiamo valutato lo splicing del minigene E1A nella proteina Nek4 stabilmente sovraespressiva di HEK293 dopo diversi trattamenti stressanti. Il protocollo include la trasfezione minigene E1A, il trattamento cellulare, l’estrazione dell’RNA e la sintesi cDNA, seguita dall’analisi PCR e gel e dalla quantificazione delle varianti spliced E1A. L’uso di questo metodo semplice e consolidato combinato con trattamenti specifici è un punto di partenza affidabile per far luce sui processi cellulari o su quali geni possono essere regolati dallo splicing dell’mRNA.
Introduction
Lo splicing è tra i passaggi più importanti nell’elaborazione dell’mRNA eucariotico che avviene simultaneamente alla tappatura a 5 mRNA e alla poliadenylazione di 3’mRNA, che comprende la rimozione dell’introne seguita dalla giunzione dell’esonero. Il riconoscimento dei siti di giunzione (SS) da parte dello spliceosoma, un complesso di ribonucleoproteine contenente piccole ribonucleoproteine (snRNP U1, U2, U4 e U6), piccoli RRNA (snRNA) e diverse proteineregolatorie 1 è necessario per la giunzione.
Oltre alla rimozione dell’introne (splicing costitutivo), negli eucarioti, gli introni possono essere conservati e gli esoni possono essere esclusi, configurando il processo chiamato mRNA alternative splicing (AS). Lo splicing alternativo pre-mRNA espande la capacità di codifica dei genomi eucarioti permettendo la produzione di un numero grande e diversificato di proteine da un numero relativamente piccolo di geni. Si stima che il 95-100% degli mRNA umani che contengono più di un esone possano subire giunzione alternativa2,3. Questo è fondamentale per processi biologici come lo sviluppo neuronale, l’attivazione dell’apoptosi e la risposta allo stress cellulare4, fornendo all’organismo alternative per regolare il funzionamento cellulare utilizzando lo stesso repertorio di geni.
La macchina necessaria per lo splicing alternativo è la stessa utilizzata per lo splicing costitutivo e l’uso delle SS è il principale fattore determinante per l’occorrenza di giunzione alternativa. Lo splicing costitutivo è correlato all’uso di forti siti di giunzione, che di solito sono più simili ai motivi di consenso per il riconoscimento spliceosoma5.
Gli esoni alternativi sono tipicamente riconosciuti in modo meno efficiente rispetto agli esoni costitutivi una volta che i suoi elementi regolatori cis-, le sequenze nelle SS di 5 e 3 che fiancheggiano questi esoni, mostrano una capacità di legame inferiore allo spliceosoma. mRNA contiene anche regioni denominate esaltatori o silenziatori situati in esoni (esaltatori di splicing esonici (ESE) e silenziatori di giunzione esonici (ESS)) e introni (esaltatori di giunzione intronica (ISE) e silenziatori di giunzione intronica (ISSS)) che migliorano o reprimeno l’uso dell’esonero,rispettivamente 5. Queste sequenze sono riconosciute da elementi transre normativi o fattori di splicing (SF). Le SFs sono rappresentate principalmente da due famiglie di proteine, i fattori di splicing ricchi di serina/arginina (SRSF) che si legano alle ESE e alla famiglia delle ribonucleoproteine nucleari eterogenee (hnRNP) che si legano alle sequenze ESS5.
Lo splicing alternativo può essere modulato mediante fosforilazione/ defosforilazione dei trans- fattori che modificano i partner delle interazioni e localizzazione cellulare dei fattori di giunzione6,7,8. L’identificazione di nuovi regolatori dei fattori di splicing può fornire nuovi strumenti per regolare lo splicing e, di conseguenza, alcuni trattamenti contro il cancro.
9, in un profilo di espressione genica del microarray di mRNA, ha osservato cambiamenti consistenti nei livelli di componenti spliceosomiali in 101 linee cellulari e dopo diverse condizioni di stress (farmaci a base di platino, irradiazione gamma, inibitori della topoisomerasi, inibitori della tirosina chinasi e taxani). La relazione tra il modello di giunzione e l’efficacia della chemioterapia è già stata dimostrata nelle cellule tumorali polmonari, che sono resistenti alla chemioterapia, mostrando cambiamenti nel tasso di varianti della caspasi-910. Le cellule HEK293 trattate con pannello chemioterapici mostrano cambiamenti nello splicing con un aumento delle varianti pro-apoptotiche. Gabriel et al.11 ha osservato cambiamenti in almeno 700 eventi di splicing dopo il trattamento con cisplatino in diverse linee cellulari, sottolineando che le vie di splicing sono influenzate dal cisplatino. I modulatori di giunzione hanno già dimostrato attività antitumorale, dimostrando che lo splicing è importante per lo sviluppo tumorale e, principalmente, la risposta chemioterapica12. Pertanto, caratterizzare nuove proteine che regolano lo splicing dopo agenti stressanti cellulari, come la chemioterapica, è molto importante per scoprire nuove strategie di trattamento.
Gli indizi di regolazione alternativa dello splicing dagli studi interactome, particolarmente importanti per caratterizzare funzioni di proteine nuove o non simple, possono richiedere un approccio più generale e semplice per verificare il ruolo reale della proteina in AS. I minigeni sono strumenti importanti per l’analisi del ruolo generale di una proteina che influisce sulla regolazione dello splicing. Contengono segmenti di un gene di interesse contenente regioni genomiche alternativamente spliced e affiancate13. L’utilizzo di uno strumento minigene consente l’analisi dello splicing in vivo con diversi vantaggi come la lunghezza del minigene che è minore e quindi non è una limitazione alla reazione di amplificazione; lo stesso minigene può essere valutato in diverse linee cellulari; tutti i componenti cellulari, principalmente la loro regolazione della modifica post-traslazionale (fosforilazione e cambiamenti nei compartimenti cellulari) sono presenti e possono essereaffrontati 13,14. Inoltre, i cambiamenti nel modello di splicing alternativo possono essere osservati dopo lo stress cellulare e, l’uso di un sistema minigene, consentono di identificare il percorso modulato da diversi stimoli.
Esistono diversi sistemi minigeni già descritti che sono specifici per diversi tipi di eventi di splicing13,14, tuttavia, come saggio preliminare, il minigene E1A15 è un sistema di reporter alternativo molto consolidato per lo studio della selezione delle SS 5 in vivo. Da un solo gene, E1A, cinque mRNA sono prodotti da splicing alternativo basato sulla selezione di tre diversi siti di giunzione 5 ′ e di uno o un sito di giunzione 3 ′ maggiore ominore 16,17,18. L’espressione delle varianti E1A cambia in base al periodo di infezione adenovirale19,20.
Abbiamo dimostrato in precedenza che entrambe le isoforme Nek4 interagiscono con fattori di giunzione come SRSF1 e hnRNPA1 e mentre isoforma 2 cambia minigene E1A splicing alternativo, isoforma 1 non ha alcun effetto inquel 21. Poiché l’isoforma 1 è l’isoforma più abbondante e cambia la resistenza alla chemioterapia e la risposta ai danni al DNA, valutiamo se potrebbe cambiare il minigene E1A alternativo in una condizione di stress.
Il test minigene è un metodo semplice, a basso costo e rapido, poiché ha solo bisogno di estrazione di RNA, sintesi cDNA, amplificazione e analisi del gel di agarosio, e può essere uno strumento utile per valutare poiché un possibile effetto sullo splicing alternativo da parte di una proteina di interessi fino all’effetto di diversi trattamenti sul modello di splicing alternativo cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
I minigeni sono strumenti importanti per determinare gli effetti nello splicing alternativo globale in vivo. Il minigene adenovirale E1A è stato utilizzato con successo per decenni per valutare il ruolo delle proteine aumentando la quantità di queste nella cellula13,14. Qui, proponiamo l’uso minigene E1A per valutare lo splicing alternativo dopo l’esposizione chemioterapeutica. Fu utilizzata una linea cellulare stabile che esprimeva l’isoforma 1 di Nek4, evitan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, attraverso Grant Temático 2017/03489-1 a JK e borsa di studio a FLB 2018/05350-3) e con il Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) per il finanziamento di questa ricerca. Vorremmo ringraziare il Dott. Adrian Krainer per aver fornito il plasmide pMTE1A e Zerler e colleghi per il loro lavoro nella clonazione E1A. Ringraziamo anche la Dott.ssa Patrícia Moriel, la Dott.ssa Wanda Pereira Almeida, il Prof.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
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