Använda E1A Minigene Tool för att studera mRNA-splitsningsändringar
Summary
Detta protokoll presenterar ett snabbt och användbart verktyg för att utvärdera rollen av ett protein med okarakteriserad funktion i alternativ splitsreglering efter kemoterapeutisk behandling.
Abstract
mRNA-bearbetning innebär flera samtidiga steg för att förbereda mRNA för översättning, såsom 5’capping, poly-A tillägg och splitsning. Förutom konstituerande splitsning tillåter alternativ mRNA splitsning uttryck av multifunktionella proteiner från en gen. Eftersom interactomestudier i allmänhet är den första analysen för nya eller okända proteiner, är associeringen av beteproteinet med splitsfaktorer en indikation på att det kan delta i mRNA-skarvningsprocess, men att avgöra i vilket sammanhang eller vilka gener som regleras är en empirisk process. En bra utgångspunkt för att utvärdera denna funktion är att använda det klassiska minigeneverktyget. Här presenterar vi adenoviral E1A minigene användning för utvärdering av alternativa splitsning förändringar efter olika cellulära stress stimuli. Vi utvärderade skarvningen av E1A minigene i HEK293 stabilt överuttryckande Nek4 protein efter olika stressande behandlingar. Protokollet omfattar E1A minigene transfection, cell behandling, RNA extraktion och cDNA syntes, följt av PCR och gel analys och kvantifiering av E1A skarvade varianter. Användningen av denna enkla och väletablerade metod i kombination med specifika behandlingar är en tillförlitlig utgångspunkt för att belysa cellulära processer eller vilka gener som kan regleras genom mRNA-splitsning.
Introduction
Splitsning är bland de viktigaste stegen i eukaryota mRNA-bearbetning som sker samtidigt till 5’mRNA-kapning och 3’mRNA polyadenylation, bestående av intronborttagning följt av exon junction. Erkännandet av skarvplatserna (SS) av skapliceosomen, ett ribonukleoproteinkomplex som innehåller små ribonukleoproteiner (snRNP U1, U2, U4 och U6), små RNAs (snRNAs) och flera regulatoriskaproteiner 1 är nödvändigt för skarvning.
Förutom intronborttagning (konstituerande skarvning), i eukaryoter, kan introner behållas och exoner kan uteslutas, vilket konfigurerar processen som kallas mRNA-alternativ splitsning (AS). Den alternativa för-mRNA splitsning utökar kodningskapaciteten för eukaryotic genom som möjliggör produktion av ett stort och varierat antal proteiner från ett relativt litet antal gener. Det uppskattas att 95-100% av mänskliga mRNAs som innehåller mer än en exon kan genomgå alternativskarvning 2,3. Detta är grundläggande för biologiska processer som neuronal utveckling, apoptosaktivering och cellulärstressrespons 4, vilket ger organismalternativen för att reglera cellens funktion med samma repertoar av gener.
De maskiner som är nödvändiga för alternativ skarvning är desamma som används för konstituerande skarvning och användningen av SS är den viktigaste avgörande faktorn för alternativ skarvförekomst. Konstituerande skarvning är relaterad till användningen av starka skarvningsplatser, som vanligtvis är mer lika konsensusmotiv för skapliceosomigenkänning5.
Alternativa exoner känns vanligtvis igen mindre effektivt än konstituerande exons en gång dess cis-reglerande element, sekvenserna i 5’SS och 3’SS flankering dessa exons, visar en sämre bindande kapacitet till skarveosome. mRNA innehåller också regioner som kallas förstärkare eller ljuddämpare i exoner (exonic skarv förstärkare (EES) och exonic skarv ljuddämpare (ESSs)) och introner (intronic skarv förstärkare (ISE) och intronic splitsande ljuddämpare (ISSs)) som förbättrar eller undertrycker exon användning,respektive 5. Dessa sekvenser känns igen av transreglerande element eller splitsfaktorer (SF). SFs representeras huvudsakligen av två familjer av proteiner, serin/arginin rika splitsfaktorer (SRSFs) som binder till EES och familjen heterogena nukleära ribonukleoproteiner (hnRNPs) som binder till ESSssekvenser 5.
Alternativ splitsning kan moduleras genom fosforylering/ defosforylering av transfaktorer som ändrar interaktionspartners och cellulär lokalisering av skarvfaktorer6,7,8. Att identifiera nya tillsynsmyndigheter för skarvningsfaktorer kan ge nya verktyg för att reglera skarvning och följaktligen vissa cancerbehandlingar.
Anufrieva et al.9, i en mRNA microarray genuttryck profil, observerade konsekventa förändringar i nivåerna av skarveosomal komponenter i 101 cellinjer och efter olika stress villkor (platina-baserade läkemedel, gamma bestrålning, topoisomerashämmare, tyrosin kinashämmare och taxaner). Förhållandet mellan splitsmönster och kemoterapi effekt har redan visats i lungcancer celler, som är kemoterapi resistenta, visar förändringar i caspase-9 varianter hastighet10. HEK293 celler behandlade med kemoterapeutiska panelen visar förändringar i splitsning med en ökning av pro-apoptotiska varianter. Gabriel et al.11 observerade förändringar i minst 700 händelser av skarvning efter cisplatin behandling i olika cellinjer, påpekar att skarvvägar är cisplatin-drabbade. Splitsande modulatorer har redan visat anti-tumoral aktivitet, visar att splitsning är viktigt för tumoral utveckling och, främst, kemoterapi svar12. Därför är det mycket viktigt att karakterisera nya proteiner som reglerar splitsning efter cellulära stressfaktorer, som kemoterapeuter, för att upptäcka nya behandlingsstrategier.
Ledtrådarna till alternativ splitsreglering från interactome-studier, särskilt viktiga för att karakterisera funktioner hos nya eller okarakteriserade proteiner, kan kräva ett mer allmänt och enkelt tillvägagångssätt för att verifiera proteinets verkliga roll i AS. Minigener är viktiga verktyg för analys av den allmänna rollen av ett protein som påverkar splitsreglering. De innehåller segment från en gen av intresse som innehåller alternativt skarvade och flankerande genomiska regioner13. Med hjälp av ett minigeneverktyg kan analysen av skarv in vivo med flera fördelar såsom längden på minigenen som är liten och därför inte är en begränsning av förstärkningsreaktionen; Samma minigen kan utvärderas i olika cellinjer. Alla cellulära komponenter, huvudsakligen deras reglerande post-translationella modifiering (fosforylering och förändringar i cellutrymmen) finns och kan behandlas13,14. Dessutom kan förändringar i alternativa splitsmönster observeras efter cellulär stress och, användning av ett minigene-system, gör det möjligt att identifiera den väg som moduleras av olika stimuli.
Det finns flera minigene-system som redan beskrivs som är specifika för olika typer av skarvningshändelser13,14, men som en preliminär analys är minigenen E1A15 ett mycket väletablerat alternativt skarvreportersystem för studier av 5:s SS-urval in vivo. Från endast en gen, E1A, produceras fem mRNAs genom alternativ skarvning baserat på val av tre olika 5′ skarvplatser och av en större eller en mindre 3′ skarvplats16,17,18. Uttrycket av E1A-varianter ändras beroende på perioden för Adenoviral infektion19,20.
Vi har tidigare visat att både Nek4-isoformer interagerar med splitsfaktorer som SRSF1 och hnRNPA1 och medan isoform 2 ändrar minigene E1A alternativ skarvning, har isoform 1 ingen effekt i det21. Eftersom isoform 1 är den vanligaste isoformen och förändrar kemoterapiresistens och DNA-skaderespons utvärderar vi om det kan förändra minigen E1A alternativ splitsning i ett stresstillstånd.
Minigene-analys är en enkel, billig och snabb metod, eftersom den bara behöver RNA-extraktion, cDNA-syntes, förstärkning och agarosgelanalyser, och kan vara ett användbart verktyg att utvärdera eftersom en möjlig effekt på alternativ skarvning av ett protein av intressen tills effekten av olika behandlingar på cellulära alternativa splitsmönster.
Protocol
Representative Results
Discussion
Minigener är viktiga verktyg för att bestämma effekterna i globala alternativa skarvningar in vivo. Adenoviral minigene E1A har använts framgångsrikt i årtionden för att utvärdera proteinernas roll genom att öka mängden av dessa icellen 13,14. Här föreslår vi minigene E1A användning för utvärdering av alternativ splitsning efter kemoterapeutisk exponering. En stabil cellinje som uttrycker Nek4 isoform 1 användes, undvika artefakter av överuttryc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, genom Grant Temático 2017/03489-1 till JK och stipendie till FLB 2018/05350-3) och Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) för finansiering av denna forskning. Vi vill tacka Dr Adrian Krainer för att ha tillhandahållit pMTE1A-plasmiden och Zerler och kollegor för deras arbete inom E1A-kloning. Vi tackar också prof. Dr. Patrícia Moriel, Prof. Dr. Wanda Pereira Almeida, Prof. Dr. Marcelo Lancellotti och Prof. Dr. Karina Kogo Cogo Müller så att vi kan använda deras laboratorieutrymme och utrustning.
Materials
| 100 pb DNA Ladder | Invitrogen | 15628-050 | |
| 6 wells plate | Sarstedt | 833920 | |
| Agarose | Sigma | A9539-250G | |
| Cisplatin | Sigma | P4394 | |
| DEPC water | ThermoFisher | AM9920 | |
| DMEM | ThermoFisher | 11965118 | |
| dNTP mix | ThermoFisher | 10297-018 | |
| Fetal Bovine Serum – FBS | ThermoFisher | 12657029 | |
| Fluorescent Microscope | Leica | DMIL LED FLUO | |
| Gel imaging acquisition system – ChemiDoc Gel Imagin System | Bio-Rad | ||
| GFP – pEGFPC3 | Clontech | ||
| HEK293 stable cells – HEK293 Flp-In | Generated from Flp-In™ T-REx™ 293 – Invitrogen and described in ref 21 | ||
| Hygromycin B | ThermoFisher | 10687010 | Used for Flp-In cells maintenemant |
| Image processing and analysis software – FIJI software | ref. 32 | ||
| Lipid- based transfection reagent – jetOPTIMUS Polyplus Reagent | Polyplus | 117-07 | |
| Oligo DT | ThermoFisher | 18418020 | |
| Paclitxel | Invitrogen | P3456 | |
| Plate Reader/ UV absorbance | Biotech | Epoch Biotek/ Take3 adapter | |
| pMTE1A plasmid | Provided by Dr. Adrian Krainer | ||
| pMTE1A F | Invitrogen | 5’ -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3 | |
| pMTE1A R | Invitrogen | 5’ -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3’ | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | F5810R | |
| Reverse Transcriptase – M-MLV | ThermoFisher | 28025013 | |
| Reverse transcriptase – Superscript IV | ThermoFisher | 18090050 | |
| Ribunuclease inhibitor RNAse OUT | ThermoFisher | 10777-019 | |
| RNA extraction phenol-chloroform based reagent – Trizol | ThermoFisher | 15596018 | |
| SybrSafe DNA gel stain | ThermoFisher | S33102 | |
| Taq Platinum | Thermo | 10966026 | |
| Tetracyclin | Sigma | T3383 | Used for Flag empty or Nek4- Flag expression induction |
| Thermocycler Bio-Rad | Bio-Rad | T100 | |
| Trypsin | Sigma | T4799 |
References
- Ule, J., Blencowe, B. J. Alternative Splicing Regulatory Networks: Functions, Mechanisms, and Evolution. Molecular Cell. 76 (2), 329-345 (2019).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nature Genetics. 40 (12), 1413-1415 (2008).
- Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463 (7280), 457-463 (2010).
- Stamm, S. Signals and their transduction pathways regulating alternative splicing: a new dimension of the human genome. Human Molecular Genetics. 11 (20), 2409-2416 (2002).
- Kornblihtt, A. R., et al. Alternative splicing: a pivotal step between eukaryotic transcription and translation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (3), 153-165 (2013).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Misteli, T., Cáceres, J. F., Clement, J. Q., Krainer, A. R., Wilkinson, M. F., Spector, D. L. Serine Phosphorylation of SR Proteins Is Required for Their Recruitment to Sites of Transcription In Vivo. Journal of Cell Biology. 143 (2), 297-307 (1998).
- Kanopka, A., et al. Regulation of adenovirus alternative RNA splicing by dephosphorylation of SR proteins. Nature. 393 (6681), 185-187 (1998).
- Anufrieva, K. S., et al. Therapy-induced stress response is associated with downregulation of pre-mRNA splicing in cancer cells. Genome Medicine. 10 (1), 49 (2018).
- Shultz, J. C., et al. SRSF1 Regulates the Alternative Splicing of Caspase 9 Via A Novel Intronic Splicing Enhancer Affecting the Chemotherapeutic Sensitivity of Non-Small Cell Lung Cancer Cells. Molecular Cancer Research. 9 (7), 889-900 (2011).
- Gabriel, M., et al. Role of the splicing factor SRSF4 in cisplatin-induced modifications of pre-mRNA splicing and apoptosis. BMC Cancer. 15, (2015).
- Lee, S. C. -. W., Abdel-Wahab, O. Therapeutic targeting of splicing in cancer. Nature Medicine. 22 (9), 976-986 (2016).
- Cooper, T. A. Use of minigene systems to dissect alternative splicing elements. Methods. 37 (4), 331-340 (2005).
- Stoss, O., Stoilov, P., Hartmann, A. M., Nayler, O., Stamm, S. The in vivo minigene approach to analyze tissue-specific splicing. Brain Research Protocols. 4 (3), 383-394 (1999).
- Zerler, B., et al. Adenovirus E1A coding sequences that enable ras and pmt oncogenes to transform cultured primary cells. Molecular and Cellular Biology. 6 (3), 887-899 (1986).
- Gattoni, R., Schmitt, P., Stevenin, J. In vitro splicing of adenovirus E1A transcripts: characterization of novel reactions and of multiple branch points abnormally far from the 3′ splice site. Nucleic Acids Research. 16 (6), 2389-2409 (1988).
- Stephens, C., Harlow, E. Differential splicing yields novel adenovirus 5 E1A mRNAs that encode 30 kd and 35 kd proteins. The EMBO journal. 6 (7), 2027-2035 (1987).
- Ulfendahl, P. J., et al. A novel adenovirus-2 E1A mRNA encoding a protein with transcription activation properties. The EMBO journal. 6 (7), 2037-2044 (1987).
- Berk, A. J., Sharp, P. A. Structure of the adenovirus 2 early mRNAs. Cell. 14 (3), 695-711 (1978).
- Svensson, C., Pettersson, U., Akusjärvi, G. Splicing of adenovirus 2 early region 1A mRNAs is non-sequential. Journal of Molecular Biology. 165 (3), 475-495 (1983).
- Basei, F. L., Meirelles, G. V., Righetto, G. L., dos Santos Migueleti, D. L., Smetana, J. H. C., Kobarg, J. New interaction partners for Nek4.1 and Nek4.2 isoforms: from the DNA damage response to RNA splicing. Proteome Science. 13 (1), 11 (2015).
- Zhou, Z., et al. The Akt-SRPK-SR Axis Constitutes a Major Pathway in Transducing EGF Signaling to Regulate Alternative Splicing in the Nucleus. Molecular Cell. 47 (3), 422-433 (2012).
- Caceres, J., Stamm, S., Helfman, D., Krainer, A. Regulation of alternative splicing in vivo by overexpression of antagonistic splicing factors. Science. 265 (5179), 1706-1709 (1994).
- Zhong, X. -. Y., Ding, J. -. H., Adams, J. A., Ghosh, G., Fu, X. -. D. Regulation of SR protein phosphorylation and alternative splicing by modulating kinetic interactions of SRPK1 with molecular chaperones. Genes & Development. 23 (4), 482-495 (2009).
- Naro, C., et al. The centrosomal kinase NEK2 is a novel splicing factor kinase involved in cell survival. Nucleic Acids Research. 42 (5), 3218-3227 (2014).
- Lu, C. -. C., Chen, T. -. H., Wu, J. -. R., Chen, H. -. H., Yu, H. -. Y., Tarn, W. -. Y. Phylogenetic and Molecular Characterization of the Splicing Factor RBM4. PLoS ONE. 8 (3), 59092 (2013).
- Jarnæss, E., et al. Splicing Factor Arginine/Serine-rich 17A (SFRS17A) Is an A-kinase Anchoring Protein That Targets Protein Kinase A to Splicing Factor Compartments. Journal of Biological Chemistry. 284 (50), 35154-35164 (2009).
- Bressan, G. C., et al. Functional association of human Ki-1/57 with pre-mRNA splicing events. FEBS Journal. 276 (14), 3770-3783 (2009).
- Vivarelli, S., et al. Paraquat Modulates Alternative Pre-mRNA Splicing by Modifying the Intracellular Distribution of SRPK2. PLoS ONE. 8 (4), 61980 (2013).
- Russell, W. C., Graham, F. L., Smiley, J., Nairn, R. Characteristics of a Human Cell Line Transformed by DNA from Human Adenovirus Type 5. Journal of General Virology. 36 (1), 59-72 (1977).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: A simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bai, Y. Control of 3′ splice site choice in vivo by ASF/SF2 and hnRNP A1. Nucleic Acids Research. 27 (4), 1126-1134 (1999).
- Cote, G. J., Nguyen, N., Lips, C. J. M., Berget, S. M., Gagel, R. F. Validation of an in vitro RNA processing system for CT/CGRP precursor mRNA. Nucleic Acids Research. 19 (13), 3601-3606 (1991).
