יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים
Summary
מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.
Abstract
עובר העופות שימש כמערכת מודל במשך יותר ממאה שנה והוביל להבנה בסיסית של התפתחות בעלי חוליות. אחת מנקודות החוזק של מערכת מודל זו היא שניתן להעריך ישירות את ההשפעה של רקמות ואינטראקציה ביניהן בעוברים כימריים. הראינו בעבר כי אותות מהמוח הקדמי תורמים למורפוגנזה של הפנים על ידי ויסות צורת תחום הביטוי של קיפוד סוניק (SHH) באזור האקטודרמלי הקדמי (FEZ). במאמר זה מתוארת השיטה ליצירת כימרות במוח הקדמי ולספק המחשות לתוצאות ניסויים אלה.
Introduction
רוב המחקר העכשווי בביולוגיה התפתחותית מתמקד בתפקידם של גנים בעיצוב עוברים. יש כלים טובים לבחון מנגנונים התפתחותיים מנקודת מבט גנטית. עם זאת, עוברים מורכבים ועוברים מורפוגנזה בתגובה לאינטראקציות בין רקמות. מערכת העופות היא כלי קלאסי המשמש להערכת מגוון אינטראקציות הרקמות המווסתות את ההתפתחות מהסיבות הבאות: האמבריולוגיה מובנת היטב, העוברים נגישים בקלות, הכלים לניתוח מערכות העופות מפותחים והעוברים זולים.
מערכת השתלות העופות נמצאת בשימוש נרחב למעקב אחר שושלות ולהערכת אינטראקציות רקמות במהלך ההתפתחות במשך כמעט מאה שנה 1,2,3,4. מערכת זו שימשה לחקר מרכז איתות, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), המווסת מורפוגנזה של הלסת העליונה5, ופורסם סרטון המתאר טכניקה זו בעבר6. בנוסף לגוזל שליו, מינים אחרים שימשו גם לייצור כימרות לניתוח אינטראקציות בין רקמות. לדוגמה, העכבר FEZ הושתל מעכברים פראיים מסוג7 ועכברים מוטנטיים8, ואחרים השתמשו במערכות ברווז, שליו ואפרוחים כדי להעריך את התפקיד של סמל עצבי בעיצוב שלד הפנים 9,10,11,12.
בעבודה זו הוערך תפקידו של המוח הקדמי בוויסות דפוס ביטוי הגנים ב-FEZ על ידי השתלת המוח הקדמי הגחוני באופן הדדי בין עוברי שליו, ברווז ואפרוחים, מאחר שנדרש אות מהמוח הקדמי כדי לגרום לביטוי קיפוד סוניק ב-FEZ. השתלות מוח קדמי אינן ייחודיות בתחום. השתלות אלה שימשו להערכת התפתחות תנועתיות בעוברי שליו וברווז13, אם כי בניסויים אלה הושתלו גם רקמות שתרמו לנגזרות לא עצביות. בעבודות אחרות, מעגלי שמיעה בציפורים הוערכו על ידי השתלת מוח קדמי14, אך השתלות אלה הכילו תאי פסגה עצביים משוערים, התורמים לצורת הפנים 9,10 ומשתתפים בוויסות הבעת SHH ב- FEZ 15. לפיכך, פותחה מערכת להשתלת המוח הקדמי הגחוני בלבד ממין אחד של ציפור למשנהו לפני סגירת הצינור העצבי כדי להעריך את תפקיד המוח בצורת פנים 16 (איור 1A,B). שיטה זו הייתה נטולת זיהום עצבי של השתל. במאמר זה מודגמת השיטה ומתוארות התוצאות הצפויות, ונדונים האתגרים הניצבים בפנינו.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת מאפשרת לבחון את יחסי הגומלין בין המוח הקדמי הבסיסי לבין האקטודרם הסמוך. גישה זו שונה משיטות השתלת מוח קדמי קודמות, מכיוון שרקמת התורם הייתה מוגבלת למוח הקדמי הגחוני. זה מבטל השתלה של תאי הפסגה העצבית, אשר הוכחו להשתתף בדפוס מורפולוגיית הפנים 9,10</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאליות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים R01DE019648, R01DE018234 ו- R01DE019638.
Materials
| 1x PBS | TEK | TEKZR114 | |
| 35×10 mm Petri dish | Falcon | 1008 | |
| DMEM | Thermofisher | 11965084 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Neutral Red | Sigma | 553-24-2 | |
| No. 5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Pasteur Pipets | Thermofisher | 13-678-6B | |
| QCPN antibody | Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA | ||
| Scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| Tungsten Needle | Fine Science Tools | 26000 |
References
- Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
- Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. 발생학. 96 (1), 144-165 (1983).
- Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
- Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
- Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. 발생학. 325 (1), 200-210 (2009).
- Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. 발생학. 374 (1), 185-197 (2013).
- Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
- Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
- Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
- Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219 (2018).
- Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
- Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477 (2012).
- Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
- Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
- Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
- Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).
