Detta arbetsflöde kan användas för att utföra antibiotikakänslighetstestning med hjälp av en etablerad ex vivo-modell av bakteriell biofilm i lungorna hos individer med cystisk fibros. Användning av denna modell kan förbättra den kliniska giltigheten av MBEC (minimal biofilm utrotning koncentration) analyser.
Den effektiva förskrivningen av antibiotika för bakteriella biofilmer som finns i lungorna hos individer med cystisk fibros (CF) begränsas av en dålig korrelation mellan ast-resultat (antibiotic susceptibility testing) med hjälp av standarddiagnosmetoder (t.ex. buljongmikrodilution, diskdiffusion eller Etest) och kliniska resultat efter antibiotikabehandling. Försök att förbättra AST genom användning av off-the-shelf biofilm tillväxtplattformar visar liten förbättring av resultaten. Den begränsade förmågan hos in vitro biofilmsystem att efterlikna den fysikaliskkemiska miljön i CF lungan och, därför bakteriell fysiologi och biofilm arkitektur, fungerar också som en broms på upptäckten av nya terapier för CF-infektion. Här presenterar vi ett protokoll för att utföra AST av CF patogener odlas som mogna, in vivo-liknande biofilmer i en ex vivo CF lungmodell bestående av gris bronkiolär vävnad och syntetisk CF sputum (ex vivo gris lunga, EVPL).
Flera in vitro-analyser finns för biofilmskänslighetstestning, med antingen standard laboratoriemedium eller olika formuleringar av syntetisk CF-sputum i mikrotiterplattor. Både tillväxtmedium och biofilmssubstrat (polystyrenplatta vs. bronkolär vävnad) kommer sannolikt att påverka biofilmantibiotiska tolerans. Vi visar ökad tolerans för kliniska Pseudomonas aeruginosa och Staphylococcus aureus isolat i ex vivo modellen; Effekterna av antibiotikabehandling av biofilmer är inte korrelerade med den lägsta hämmande koncentrationen (MIC) i standardanalyser för mikrodilution eller en känslig/resistent klassificering i diskdiffusionsanalyser.
Ex vivo-plattformen skulle kunna användas för skräddarsydd biofilm AST av patientprover och som en förbättrad testplattform för potentiella antibiofilmsmedel under läkemedelsforskning och utveckling. Att förbättra receptet eller accelerationen av antibiofilm läkemedelsupptäckt genom användning av mer in vivo-liknande testplattformar kan drastiskt förbättra hälsoresultaten för individer med CF, samt minska kostnaderna för klinisk behandling och upptäcktsforskning.
Kroniska biofilmsinfektioner drabbar individer vars normala immunförsvar äventyras. Riskgrupper inkluderar de med det genetiska tillståndet cystisk fibros (CF)1. Kolonisering av onormalt tjock, självhäftande slem i luftvägarna i tidig barndom leder till svårbehandlade biofilminfektioner i bronkiolerna2,3. Tillväxten av bakterier som omfattande matrisinkapslade biofilmer är en faktor som skiljer kroniska infektioner hos immunkomprometterade människor från akuta infektioner hos friska värdar och biofilmstillståndet skyddar båda bakterier från antibiotikaexponering (på grund av minskad diffusion genom matrisen) och minskar deras antibiotikakänslighet (t.ex. genom induktion av quiescence eller uppreglering av effluxpumpar)4,5. Sjukdomsspecifika förändringar i värdvävnadsfysiologi och kemi förändrar dock ytterligare bakteriefysiologin från den som observerats vid akuta infektioner eller i normala laboratorietillväxtförhållanden. Viktiga exempel inom CF inkluderar användning av ovanliga kolkällor, såsom fettsyror och aminosyror som frigörs från lungsurfaktant och produceras genom mikrobiell nedbrytning av mucin, frisättning av mikronäringsämnen, såsom järn från skadade vävnader, och mikroatobios6,7,8.
De specifika fysikalisk-kemiska förhållandena i ett visst biofilmsinfektionssammanhang kan därför påverka svaren på antibiotika. För det första beror strukturen och djupet på den extracellulära matrisen på lokala miljöförhållanden, såsom näringsämnen eller savkrafter. För det andra kan miljösignaler utlösa uttryck för specifika antibiotikaresistensgener. Till exempel visar CF patogenen Pseudomonas aeruginosa ökat uttryck för en beta-laktamas och minskat uttryck av poriner i CF sputum kontra in vitro9, medan en annan CF patogen, Burkholderia cenocepacia, uppreglerar beta-laktamaser och efflux pumpar när de odlas i CF sputum10. För det tredje kan värdförhållanden leda till en fysiologisk eller genetisk övergång till antibiotikatoleranta fenotyper, som är svåra att rekapitulera in vitro. Dessa inkluderar små kolonivarianter av CF patogen staphylococcus aureus11,12.
Alla dessa data indikerar att när diagnostiska laboratorier isolerar enskilda kloner från patogen biofilm och utför AST på planktoniska eller agarplåtodlade kulturer i standard laboratoriemedier (buljongmikrodilution, diskdiffusion eller Etest), förutspår resultaten ofta inte vilka antibiotika som faktiskt kommer att fungera in vivo. Även om biofilmsanalyser in vitro används får de inte visa en in vivo-liknande biofilms fenotyp på grund av skillnader i den medium- och fästyta som används, så analyser med hjälp av flödesceller eller mikroplåtsplattformar med högt genomströmning kan överskatta antibiotikakänsligheten13. Samma problem gäller forskare inom akademi och industri som försöker utveckla nya antibiofilmsmedel: att testa läkemedelspotentialen med hjälp av in vitro-plattformar som flödesceller, mikrotiterplattor eller Biofilmreaktorer för center for Disease Control kan sätta biofilmseffektstången för låg och producera falska positiva resultat i forsknings-, utvecklingspipeline.
Den dåliga korrelationen mellan AST resultat och kliniska resultatet efter antibiotiska behandling i CF är välkänd. Många kliniker ignorerar helt enkelt diagnostiska lab AST eftersom det inte finns några enhetliga, CF-specifika riktlinjer för att tolka dessa resultat och istället fatta beslut från fall till fall för förskrivning. Försök har gjorts att förbättra CF AST med hjälp av Calgary biofilm enhet, som använder biofilm som odlas på ytan av plastpinnar som är inställda i brunnarna i en mikroplatta som innehåller standard AST medium (t.ex. katjonjusterad Muller-Hinton buljong)14,15. Denna analys gör inte bättre på att förutsäga vilka antibiotika som kommer att fungera in vivo än standard planktonISK AST16. Påverkan på patienter med CF är stark. Trots upprepad antibiotika administrering (regelbunden inhalerad antibiotika och en median på 27 dagar/år som får intravenös antibiotika för individer med CF i Storbritannien)17, leder frekventa och oförutsägbara episoder av akut lungförvärring till progressiva lungskador och, i cirka 90% av fallen, död från andningssvikt. I en nyligen genomförd analys var bakteriell lunginfektion den starkaste prediktorn för läkemedelskostnader i CF, vilket i genomsnitt lade till € 3.6K / patient / år för att riktasjukvårdskostnaderna 18,19.
För akuta infektioner hos annars friska individer är aktuell forskning och politik med fokus på snabb AST baserad på till exempel point-of-care genomisk förutsägelse idealisk20. Men när det gäller kroniska CF-infektioner är det uppenbart att ett annat tillvägagångssätt behövs: genomförandet av AST i värd-härmande modeller som bättre rekapitulera in vivo-miljön och patogenmetaboliskt tillstånd och möjliggör bildandet av realistisk biofilmstruktur.
Vi har tidigare utvecklat en CF biofilm modell som omfattar delar av gris bronkiol inkuberas i syntetisk CF sputum och infekteras med P. aeruginosa eller S. aureus. Oinfekterad EVPL behåller normal histopatologi i 7 dagar men lab eller kliniska isolat av P. aeruginosa och S. aureus bildar reproducerbart in vivo-liknande aggregat runt vävnaden, härma etiologin för CF-infektion21,22,23. Vi presenterar ett protokoll för att använda denna hög giltighets-, höggenomströmningsmodell som en skräddarsydd biofilm AST-plattform för CF och presenterar exemplariska resultat som visar den höga toleransen för patogena biofilmer till kliniskt använda antibiotika när de odlas i modellen. Modellen skulle lätt kunna införlivas i forskning, utvecklingspipeline för hantering eller förebyggande av biofilmsbildning och potentiellt i diagnostisk AST. De flesta utrustningar som används (se Tabell över material) kan lätt hittas i ett typiskt mikrobiologilaboratorium, även om en pärlslagare är nödvändig, och vi har funnit från arbete med samarbetspartners att ett lämpligt ultraviolett germicidalskåp också kan behöva anskaffas. Eftersom lungorna kommer från kommersiella slaktare eller slakterier utgör modellen inga etiska problem.
Ex vivo-lungmodellen är hög genomströmning och billig, och eftersom den använder avfall efter konsument från köttindustrin utgör den inga etiska problem. Det är utformat för att efterlikna kroniskt infekterade mänskliga CF-luftvägar bättre än vad som för närvarande finns tillgängligt, in vitro AST-plattformar. Resultaten som presenteras här visar att det mer exakt kan förutsäga antibiotikakänslighet under dessa omständigheter.
Kritiska steg i protokollet som säkerställer, tillförlitliga och reproducerbara resultat inkluderar följande:
Detta protokoll producerar en robust prototypmodell för användning med P. aeruginosa, med stor potential för utveckling för användning med S. aureus, men det har vissa begränsningar som kommer att behöva åtgärdas för vissa applikationer i framtiden. Vävnad var inokulerad från enstaka kolonier för att möjliggöra utvecklingen av klonurcancer populationer. Resultaten visar att för P. aeruginosahar detta liten inverkan på cellnummer vid 48 h. Större variation i bakteriebelastning observerades dock för S. aureus och med tanke på att olika bakterier kan växa olika inom modellen kan en standardiserad startinokulat och rigorös produktion av vävnadsprover av identisk storlek och vikt vara beroende av organismen i studien. Det kan också finnas skillnader mellan laboratorier på grund av skillnader i exakta dissekerings-/infektionstekniker eller lokal grisras/landrace. För att bedöma bakteriepopulationernas reproducerbarhet för enskilda implementeringar av modellen föreslår vi att repeterbarhetsberäkningar används som en del av den statistiska analysen av resultat25 och användningen av repeterbarhet/effektberäkningar baserade på pilotexperiment för att beräkna den optimala provstorleken för deras användning i slutliga experiment.
En av de viktigaste fördelarna med EVPL jämfört med traditionella plattanalyser är att i stället för att testa för bakterier som växer planktoniskt eller på abiotiska ytor möjliggör det rumslig strukturering av bakteriella biofilmer i en värdmiljö och med cell differentiering. Detta har viktiga konsekvenser för att överväga effekten av fysiokemiska och näringsmässiga gradienter på aktiviteten hos antimikrobiella medel samt leverans och tillgänglighet av aktiva terapier vid olika mikromiljöer inom en kronisk infektion och cellcellsinteraktion mellan bakterier. Denna senare punkt är särskilt viktig, eftersom multispecies infektioner observeras rutinmässigt i CF och blir allt viktigare för infektioner i samband med andra andningsbesvär, såsom astma och kronisk obstruktiv lungsjukdom. Det finns potential att utveckla denna modell för AST för individualiserad patienten sputum provtagning i den kliniska diagnostiken. En analog studie pågår redan med hjälp av en sår-härma in vitro-modell för tillväxt och AST av debrided biofilm från kroniska sår (Southwest Regional Wound Care Center i Lubbock, Texas, Dr. R. Wolcott).
Dessutom använder modellen post-mortem vävnad, så påverkan av värden immunsvar på antibiotika mottaglighet är begränsad. Nuvarande in vitro-modeller tar inte heller hänsyn till värd immunsvar, så vi ser inte detta som ett hinder för den framtida användningen av modellen i AST-applikationer. Immunsvaret beaktas dock när farmakokinetiska och farmakodynamiska parametrar och riktlinjer för dosering av antibiotika fastställs. Även om våra studier har visat bevis på kvarvarande immunceller och svar inomvävnaden 23 (och S. Azimi, personlig kommunikation), är detta ett utmärkt område för ytterligare optimering och utveckling av modellen om en större matchning till in vivo villkor önskas.
Att tillhandahålla mer kliniskt giltig AST för CF kommer att hjälpa till att uppfylla en viktig rekommendation från UK Health, Social Care Act 2008 att “förfaranden bör finnas för att säkerställa försiktig förskrivning och antimikrobiell förvaltning.” Vi anser att EVPL är en idealisk kandidatmodell för att hjälpa till att möta detta behov.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla våra medförfattare för de ursprungliga dokument från vilka vi har tagit föredömliga resultat. Arbetet finansierades av ett MRC New Investigator Research Grant (anslagsnummer MR/R001898/1)som tilldelats FH; av doktorander från BBSRC Midlands Integrative Biosciences Training Partnership (MIBTP) som tilldelats NEH och IA; och av University of Warwick Undergraduate Research Support Schemes utmärkelse till FA för att genomföra ett sommarlovsforskningsprojekt. Vi tackar Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) och John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) för att de levererar lungor. Vi vill också uppmärksamma hjälpen från Media Preparation Facility vid School of Life Sciences vid University of Warwick, med särskilt tack till Cerith Harries och Caroline Stewart, och hjälp av Anita Catherwood vid Warwick Antimicrobial Screening Facility.
0.5 mL insulin syringes with 29G needle attached | |||
24-well culture plates | |||
70% ethanol or similar for surface sterilizaton and flamin gof dissection equipment | |||
Agar plates to prepare streaks of P. aeruginosa/S. aureus (any suitable medium) | |||
Agarose | |||
Aluminum foil – pre-sterilised by autoclaving – to cover the chopping board on whcih you wil dissect lungs. | |||
Bead beater designed to take 2 mL tubes | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic bead beating grinder and lysis system |
Breathe-easy or Breathe-easier sealing membrane for multiwell plates | Diversified Biotech | BEM-1 or BERM-2000 | |
Bunsen burner | |||
Chopping board – we recommend a plastic board to allow for easy decontamination with alcohol. | |||
Coolbox to transport lungs to lab | |||
Dissection scissors in different sizes | |||
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | |||
Fisherbrand 2 mL reinforced tubes | Thermo Fisher | 15545809 | |
Fisherbrand 2.38 mm metal beads | Thermo Fisher | 15505809 | |
Germicidal UV cabinet | |||
Insulin syringes - 0.5 mL with 29G needle attached. | VWR | BDAM324892 | |
Large pallet knife | |||
LB agar plates to assess CFU in lung biofilm homogenate | |||
Mounted razor blades | |||
Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm x 500 ml sterile filter unit | Thermo Fisher | 10474415 | For filter-sterilizing SCFM |
Petri dishes | |||
Phosphate-buffered saline | |||
Plastic chopping board and aluminium foil to create a sterile and cleanable dissection surface | |||
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | |||
SCFM ingredients as listed in Table S1 | |||
Selection of forceps (blunt tips recommended) | |||
Selective agar plates to specifically assess P. aeruginosa / S. aureus CFU in lung biofilm homogenate, if required. | |||
Suitable containers for disposing of contaminated sharps and pig ung tissue, according to your institution's health & safety policies. |