Brug af kyllingembryo som et kraftfuldt værktøj til vurdering af udviklingsmæssige kardiotoksiciteter

Summary

Kyllingembryoner, som en klassisk udviklingsmodel, bruges i vores laboratorium til at vurdere udviklingsmæssige kardiotoksiciteter efter eksponering for forskellige miljøforurenende stoffer. Eksponeringsmetoder og morfologiske/funktionelle vurderingsmetoder er beskrevet i dette manuskript.

Abstract

Kyllingembryoner er en klassisk model i udviklingsstudier. Under udviklingen af kyllingembryoner er tidsvinduet for hjerteudvikling veldefineret, og det er relativt let at opnå præcis og rettidig eksponering via flere metoder. Desuden ligner processen med hjerteudvikling i kyllingembryoner pattedyr, hvilket også resulterer i et firekammerhjerte, hvilket gør det til en værdifuld alternativ model i vurderingen af udviklingsmæssige kardiotoksiciteter. I vores laboratorium anvendes kyllingembryonermodellen rutinemæssigt til vurdering af udviklingsmæssige kardiotoksiciteter efter eksponering for forskellige miljøforurenende stoffer, herunder per- og polyfluoroalkylstoffer (PFAS), partikler (PM’er), dieseludstødning (DE) og nanomaterialer. Eksponeringstiden kan frit vælges ud fra behovet fra udviklingsstart (embryonal dag 0, ED0) hele vejen til dagen før klækning. De vigtigste eksponeringsmetoder omfatter luftcelleinjektion, direkte mikroinjektion og indånding af luftceller (oprindeligt udviklet i vores laboratorium), og de aktuelt tilgængelige slutpunkter omfatter hjertefunktion (elektrokardiografi), morfologi (histologiske vurderinger) og molekylære biologiske vurderinger (immunohistochemistry, qRT-PCR, vestlig blotting osv.). Selvfølgelig har kyllingembryonermodellen sine egne begrænsninger, såsom begrænset tilgængelighed af antistoffer. Ikke desto mindre, med flere laboratorier begynder at udnytte denne model, kan det bruges til at yde betydelige bidrag til studiet af udviklingsmæssige kardiotoksicities.

Introduction

Kyllingembryoet er en klassisk udviklingsmodel, som har været brugt i over to hundrede år¹. Kyllingembryomodellen har forskellige fordele sammenlignet med traditionelle modeller. Først og fremmest var den normale udvikling af kyllingembryoet allerede for over 70 år siden blevet illustreret meget tydeligt i Hamburger-Hamilton-iscenesættelsesvejledning², hvor i alt 46 faser under udvikling af kyllingembryoner blev defineret med præcise tidsmæssige og morfologiske egenskaber, hvilket lettede påvisningen af unormal udvikling. Derudover har kyllingembryonermodellen andre funktioner såsom at være relativt billig og overflødig i mængde, relativt nøjagtige eksponeringsdosiskontroller, et uafhængigt, lukket system i skallen og let manipulation af det udviklende embryo, som alle garanterer, at dets potentiale kan bruges som en kraftfuld toksikologisk vurderingsmodel.

I kardiotoksicitet har kyllingembryoet et firekammerhjerte, der ligner pattedyrshjerter, men med tykkere vægge, hvilket giver lettere morfologiske vurderinger. Derudover giver kyllingembryoet mulighed for udviklingsmæssig indåndingseksponering, hvilket ikke er muligt i pattedyrmodeller: I det senere udviklingsstadium vil kyllingembryoet skifte fra internt åndedræt til eksternt åndedræt (få ilt via lungen); sidstnævnte kræver, at embryoet trænger ind i luftcellemembranen med næb og begynder at trække vejret luft³, hvilket gør luftcellen til et mini-indåndingskammer. Ved hjælp af dette fænomen kan de toksikologiske virkninger af gasforurenende stoffer på hjertet (og andre organer) vurderes uden behov for dedikerede inhalationskammerinstrumenter.

I dette manuskript beskrives flere eksponerings-/slutpunktsvurderingsmetoder, som alle tjener til at gøre kyllingembryoet til et effektivt værktøj til vurdering af udviklingskardiotoksicitet efter eksponering for miljøforurenende stoffer.

Protocol

Alle de beskrevne procedurer blev godkendt af Institutionss komitéen (IACUC) ved Qingdao University. I vores laboratorium blev æggene inkuberet i to inkubatorer. Æg blev holdt oprejst i inkubatoren og tilfældigt placeret på hylderne. Rugeforholdene for æggene var som følger: inkubationstemperaturen startede ved 37,9 °C og faldt gradvist til 37,1 °C, efterhånden som inkubationen fortsatte; fugtigheden startede ved 50% og steg gradvist til 70%. 1. Eksponeringsmetoder <p class="jove_c…

Representative Results

EksponeringsresultaterIndsprøjtning af luftcellerLuftcelleinjektion kan effektivt udsætte udvikling af kyllingembryoner for forskellige midler, som efterfølgende kan påvises i de indsamlede prøver (serum, væv osv.) af embryoner/rugekyllinger. Her er et eksempel, hvor perfluoroctanosyre (PFOA) blev injiceret i luftceller, og serum PFOA-koncentrationer blev derefter bestemt med ultraperformet væskekromatografi-massespektrometri. Serumkoncentrationerne svarede til de injicerede doser, hvilket indikerer effekt…

Discussion

Kyllingembryoet har været en klassisk model i udviklingsstudier i 200 år¹. Vores metoder præsenteret i dette manuskript er blevet brugt i vurderingen af flere miljøforurenende stoffer, herunder perfluoroctanosyre, partikler og dieseludstødning med succes^{5,7,8,9,10,11,1…}

Materials

4% phosphate buffered formaldehydefixative	Biosharp, Hefei, China	REF: BL539A
75% ethanol	Guoyao,Shanghai,China	CAS:64-17-5
Biosignaling monitor BL-420E+	Taimeng, Chengdu, China	BL-420E+
Candling lamp	Zhenwei, Dezhou, China	WZ-001
Disposable syringe	Zhiyu, Jiangsu, China
Egg incubator	Keyu,Dezhou, China	KFX
Electrical balance	OHAUS, Shanghai, China	AR 224CN
Electro-thermal incubator	Shenxian, Shanghai, China	DHP-9022
Ethanol absolute	Guoyao,Shanghai,China	CAS:64-17-5
Fertile chicken egg	Jianuo, Jining, China
Hematoxylin and Eosin Staining Kit	Beyotime, Bejing, China	C0105
Histology paraffin	Aladdin, Shanghai, China	P100928-500g	Melt point 52~54°C
Histology paraffin	Aladdin, Shanghai, China	P100936-500g	Melt point 62~64°C
IV catheter	KDL, Zhejiang, China		The catheters have to be soft, plastic ones.
Lentivirus	Genechem, Shanghai, China		The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem.
Masson's trichrome staining kit	Solarbio, Beijing, China	G1340
Metal probe	Jinuotai, Beijing, China
Microinjector (5 uL)	Anting,Shanghai, China
Microscope	CAIKON, Shanghai, China	XSP-500
Microtome	Leica, Germany	HistoCore BIOCUT
Microtome blade	Leica,Germany	Leica 819
Pentobarbitual sodium	Yitai Technology Co. Ltd.,  Wuhan, China	CAS: 57-33-0
Pipetter(10ul)	Sartorius, Germany
Povidone iodide	Longyuquan, Taian, China
Scissor	Anqisheng,Suzhou, China
Sterile saline	Kelun,Chengdu, China
Sunflower oil	Mighty Jiage, Jiangsu, China		Any commerical sunflower oil for human consumption should work
Tape	M&G, Shanghai, China
Tedlar PVF Bag (5L)	Delin, Dalian, China
Vortex mixer	SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US	MX-F
Xylene	Guoyao,Shanghai,China	CAS:1330-20-7