Verwendung von Hühnerembryon als leistungsfähiges Werkzeug bei der Beurteilung von Entwicklungskardiotoxizitäten
Summary
Hühnerembryonen werden als klassisches Entwicklungsmodell in unserem Labor verwendet, um Entwicklungskardiotoxizitäten nach Exposition gegenüber verschiedenen Umweltkontaminanten zu bewerten. Expositionsmethoden und morphologische/funktionelle Bewertungsmethoden werden in diesem Manuskript beschrieben.
Abstract
Hühnerembryonen sind ein klassisches Modell in Entwicklungsstudien. Während der Entwicklung von Hühnerembryonen ist das Zeitfenster der Herzentwicklung gut definiert, und es ist relativ einfach, eine präzise und rechtzeitige Exposition durch mehrere Methoden zu erreichen. Darüber hinaus ähnelt der Prozess der Herzentwicklung bei Hühnerembryonen Säugetieren, was auch zu einem Vierkammerherz führt, was es zu einem wertvollen alternativen Modell bei der Beurteilung von Entwicklungskardiotoxizitäten macht. In unserem Labor wird das Hühnerembryomodell routinemäßig bei der Bewertung von Entwicklungskardiotoxizitäten nach Exposition gegenüber verschiedenen Umweltschadstoffen verwendet, darunter Per- und Polyfluoralkylsubstanzen (PFAS), Feinstaub (PMs), Dieselabgase (DE) und Nanomaterialien. Die Belichtungszeit kann je nach Bedarf frei gewählt werden, vom Beginn der Entwicklung (Embryonaltag 0, ED0) bis zum Tag vor dem Schlüpfen. Zu den wichtigsten Expositionsmethoden gehören Luftzellinjektion, direkte Mikroinjektion und Luftzellinhalation (ursprünglich in unserem Labor entwickelt), und die derzeit verfügbaren Endpunkte umfassen Herzfunktion (Elektrokardiographie), Morphologie (histologische Bewertungen) und molekularbiologische Bewertungen (Immunhistochemie, qRT-PCR, Western Blotting usw.). Natürlich hat das Hühnerembryomodell seine eigenen Grenzen, wie z.B. die begrenzte Verfügbarkeit von Antikörpern. Da jedoch immer mehr Labore beginnen, dieses Modell zu verwenden, kann es verwendet werden, um signifikante Beiträge zur Untersuchung von Entwicklungskardiotoxizitäten zu leisten.
Introduction
Der Hühnerembryo ist ein klassisches Entwicklungsmodell, das seit über zweihundert Jahren verwendet wird1. Das Hühnerembryo-Modell hat verschiedene Vorteile gegenüber traditionellen Modellen. Zunächst einmal war bereits vor über 70 Jahren die normale Entwicklung des Hühnerembros sehr deutlich im Hamburger-Hamilton Staging Guide2dargestellt worden, in dem insgesamt 46 Stadien während der Hühnerembryoentwicklung mit genauen zeitlichen und morphologischen Merkmalen definiert wurden, was den Nachweis abnormaler Entwicklungen erleichterte. Darüber hinaus weist das Hühnerembryomodell weitere Merkmale auf, wie z. B. relativ kostengünstig und redundant in der Menge, relativ genaue Expositionsdosiskontrollen, ein unabhängiges, geschlossenes System innerhalb der Schale und eine einfache Manipulation des sich entwickelnden Embryos, die alle sein Potenzial garantieren, als leistungsfähiges toxikologisches Bewertungsmodell verwendet zu werden.
Bei der Kardiotoxizität weist der Hühnerembryo ein Vierkammerherz auf, ähnlich wie Säugetierherzen, aber mit dickeren Wänden, was eine einfachere morphologische Beurteilung ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht der Hühnerembryo eine Entwicklungsinhalationsexposition, die in Säugetiermodellen nicht möglich ist: Im späteren Entwicklungsstadium wechselt der Hühnerembryo von der inneren Atmung zur externen Atmung (Sauerstoff über die Lunge erhalten); Letzteres erfordert, dass der Embryo mit dem Schnabel in die Luftzellmembran eindringt und beginnt, Luft zu atmen3, wodurch die Luftzelle zu einer Mini-Inhalationskammer wird. Unter Ausnutzung dieses Phänomens können die toxikologischen Wirkungen von Gasverunreinigungen auf das Herz (und andere Organe) bewertet werden, ohne dass spezielle Inhalationskammerinstrumente erforderlich sind.
In diesem Manuskript werden mehrere Expositions- / Endpunktbewertungsmethoden beschrieben, die alle dazu dienen, den Hühnerembryo zu einem leistungsfähigen Werkzeug bei der Beurteilung der Entwicklungskardiotoxizität nach Exposition gegenüber Umweltkontaminanten zu machen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Hühnerembryo ist seit 200 Jahren ein klassisches Modell in Entwicklungsstudien1. Unsere in diesem Manuskript vorgestellten Methoden wurden bei der Bewertung mehrerer Umweltkontaminanten, einschließlich Perfluoroctansäure, Feinstaub und Dieselabgasen, mit Erfolg5,7,8,9,10,11,<sup class…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
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