שימוש בעובר עוף ככלי רב עוצמה להערכת לב-קרדיוקסיות התפתחותית
Summary
עוברים עוף, כמודל התפתחותי קלאסי, משמשים במעבדה שלנו להערכת cardiotoxicic התפתחותי בעקבות חשיפה מזהמים סביבתיים שונים. שיטות חשיפה ושיטות הערכה מורפולוגיות/פונקציונליות שנקבעו מתוארות בכתב יד זה.
Abstract
עוברי עוף הם מודל קלאסי במחקרים התפתחותיים. במהלך התפתחות עוברים עוף, חלון הזמן של התפתחות הלב מוגדר היטב, וזה יחסית קל להשיג חשיפה מדויקת בזמן באמצעות שיטות מרובות. יתר על כן, תהליך התפתחות הלב בעוברי עוף דומה ליונקים, וכתוצאה מכך גם לב בעל ארבעה תאים, מה שהופך אותו למודל חלופי בעל ערך בהערכת הלב-קרדיו-קסיות ההתפתחותית. במעבדה שלנו, מודל עובר העוף משמש באופן שגרתי להערכת לב-קרדיוקסיה התפתחותית בעקבות חשיפה למזהמים סביבתיים שונים, כולל חומרים פר ופוליפלואורואלקיל (PFAS), חומר חלקיקי (PMs), פליטת דיזל (DE) וחומרי ננו. זמן החשיפה ניתן לבחור בחופשיות על פי הצורך, מתחילת ההתפתחות (יום עוברי 0, ED0) כל הדרך ליום שלפני הבקיעה. שיטות החשיפה העיקריות כוללות הזרקת תאי אוויר, מיקרו-בייג’ינג ישיר ושאיפת תאי אוויר (שפותחה במקור במעבדה שלנו), ונקודות הקצה הקיימות כיום כוללות תפקוד לב (אלקטרוקרדיוגרפיה), מורפולוגיה (הערכות היסטולוגיות) והערכות ביולוגיות מולקולריות (אימונוהיסטוכימיה, qRT-PCR, סופג מערבי וכו ‘). כמובן, מודל עובר העוף יש מגבלות משלו, כגון זמינות מוגבלת של נוגדנים. עם זאת, עם מעבדות נוספות מתחיל לנצל מודל זה, זה יכול לשמש כדי לתרום תרומות משמעותיות לחקר הלב-טוקוקסיות ההתפתחותיות.
Introduction
עובר העוף הוא מודל התפתחותי קלאסי, אשר שימש במשך למעלה ממאתיים שנה1. למודל עובר העוף יתרונות שונים בהשוואה לדגמים מסורתיים. קודם כל, כבר לפני למעלה מ -70 שנה, ההתפתחות הרגילה של עובר העוף הודגמה בצורה ברורה מאוד במדריך ההיערכות המבורגר-המילטון2, שבו הוגדרו בסך הכל 46 שלבים במהלך התפתחות עובר העוף עם זמן מדויק ומאפיינים מורפולוגיים, מה שמקל על זיהויים של התפתחות חריגה. בנוסף, למודל העובר העוף יש תכונות אחרות כגון היותו בעלות נמוכה יחסית ויתיר בכמות, בקרות מינון חשיפה מדויקות יחסית, מערכת עצמאית וסגורה בתוך הקליפה ומניפולציה קלה של העובר המתפתח, כל אלה מבטיחים את הפוטנציאל שלו לשמש כמודל הערכה טוקסיקולוגי רב עוצמה.
בקרדיו-קרדיוקסיה, עובר העוף כולל לב בעל ארבעה תאים, בדומה ללבבות יונקים אך עם קירות עבים יותר, המאפשר הערכות מורפולוגיות קלות יותר. בנוסף, עובר העוף מאפשר חשיפה לשאיפה התפתחותית, שאינה אפשרית במודלים של יונקים: בשלב מאוחר יותר של ההתפתחות, עובר העוף יעבור מנשימה פנימית לנשימה חיצונית (קבלת חמצן דרך הריאה); האחרון דורש כי העובר חודר את קרום תא האוויר עם מקור, ומתחיל לנשום אוויר 3 , מהשהופךאת תא האוויר תא שאיפה מיני. תוך שימוש בתופעה זו, ניתן להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגיות של מזהמי גז על הלב (ואיברים אחרים) ללא צורך במכשירי תא שאיפה ייעודיים.
בכתב יד זה מתוארות מספר שיטות להערכת נקודות קצה, אשר כולן משמשות כדי להפוך את עובר העוף לכלי רב עוצמה בהערכת לב-קרדיוקסיה התפתחותית בעקבות חשיפה למזהמים סביבתיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עובר העוף היה מודל קלאסי במחקרים התפתחותיים במשך 200 שנה1. השיטות שלנו שהוצגו בכתב יד זה שימשו להערכה של מספר מזהמים סביבתיים, כולל חומצה פרפלואורוקטנואית, חומר חלקיקי, פליטת דיזל בהצלחה5,7,8,9,1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (Grant No. 91643203, 91543208, 81502835).
Materials
| 4% phosphate buffered formaldehydefixative | Biosharp, Hefei, China | REF: BL539A | |
| 75% ethanol | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Biosignaling monitor BL-420E+ | Taimeng, Chengdu, China | BL-420E+ | |
| Candling lamp | Zhenwei, Dezhou, China | WZ-001 | |
| Disposable syringe | Zhiyu, Jiangsu, China | ||
| Egg incubator | Keyu,Dezhou, China | KFX | |
| Electrical balance | OHAUS, Shanghai, China | AR 224CN | |
| Electro-thermal incubator | Shenxian, Shanghai, China | DHP-9022 | |
| Ethanol absolute | Guoyao,Shanghai,China | CAS:64-17-5 | |
| Fertile chicken egg | Jianuo, Jining, China | ||
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Beyotime, Bejing, China | C0105 | |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100928-500g | Melt point 52~54°C |
| Histology paraffin | Aladdin, Shanghai, China | P100936-500g | Melt point 62~64°C |
| IV catheter | KDL, Zhejiang, China | The catheters have to be soft, plastic ones. | |
| Lentivirus | Genechem, Shanghai, China | The lentivirus were individually designed/synthesized by Genechem. | |
| Masson's trichrome staining kit | Solarbio, Beijing, China | G1340 | |
| Metal probe | Jinuotai, Beijing, China | ||
| Microinjector (5 uL) | Anting,Shanghai, China | ||
| Microscope | CAIKON, Shanghai, China | XSP-500 | |
| Microtome | Leica, Germany | HistoCore BIOCUT | |
| Microtome blade | Leica,Germany | Leica 819 | |
| Pentobarbitual sodium | Yitai Technology Co. Ltd., Wuhan, China | CAS: 57-33-0 | |
| Pipetter(10ul) | Sartorius, Germany | ||
| Povidone iodide | Longyuquan, Taian, China | ||
| Scissor | Anqisheng,Suzhou, China | ||
| Sterile saline | Kelun,Chengdu, China | ||
| Sunflower oil | Mighty Jiage, Jiangsu, China | Any commerical sunflower oil for human consumption should work | |
| Tape | M&G, Shanghai, China | ||
| Tedlar PVF Bag (5L) | Delin, Dalian, China | ||
| Vortex mixer | SCILOGEX, Rocky Hill, CT, US | MX-F | |
| Xylene | Guoyao,Shanghai,China | CAS:1330-20-7 |
References
- Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics. 243 (2), 216-228 (2014).
- Menna, T. M., Mortola, J. P. Effects of posture on the respiratory mechanics of the chick embryo. Journal of Experimental Zoology. 293 (5), 450-455 (2002).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Yamamoto, F. Y., Neto, F. F., Freitas, P. F., Oliveira Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Cadmium effects on early development of chick embryos. Environmental Toxicology and Pharmacology. 34 (2), 548-555 (2012).
- Lv, N., et al. The roles of bone morphogenetic protein 2 in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection. Toxicology and Applied Pharmacology. 352, 68-76 (2018).
- Kmecick, M., Vieira da Costa, M. C., Oliveria Ribeiro, C. A., Ortolani-Machado, C. F. Morphological evidence of neurotoxic effects in chicken embryos after exposure to perfluorooctanoic acid (PFOA) and inorganic cadmium. Toxicology. 4227, 152286 (2019).
- Jiang, Q., Lust, R. M., Strynar, M. J., Dagnino, S., DeWitt, J. C. Perflurooctanoic acid induces developmental cardiotoxicity in chicken embryos and hatchlings. Toxicology. 293 (1-3), 97-106 (2012).
- Jiang, Q., et al. In ovo very early-in-life exposure to diesel exhaust induced cardiopulmonary toxicity in a hatchling chick model. Environmental Pollution. 264, 114718 (2020).
- Jiang, Q., Lust, R. M., DeWitt, J. C. Perfluorooctanoic acid induced-developmental cardiotoxicity: are peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARalpha) and bone morphorgenic protein 2 (BMP2) pathways involved. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 76 (11), 635-650 (2013).
- Jiang, Q., et al. Changes in the levels of l-carnitine, acetyl-l-carnitine and propionyl-l-carnitine are involved in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity in chicken embryo. Environmental Toxicology and Pharmacology. 48, 116-124 (2016).
- Zhao, M., et al. The role of PPAR alpha in perfluorooctanoic acid induced developmental cardiotoxicity and l-carnitine mediated protection-Results of in ovo gene silencing. Environmental Toxicology and Pharmacology. 56, 136-144 (2017).
- Jiang, Q., et al. Particulate Matter 2.5 Induced Developmental Cardiotoxicity in Chicken Embryo and Hatchling. Front Pharmacol. 11, 841 (2020).
- Molina, E. D., et al. Effects of air cell injection of perfluorooctane sulfonate before incubation on development of the white leghorn chicken (Gallus domesticus) embryo. Environmental Toxicology and Chemistry. 25 (1), 227-232 (2006).
- Crump, D., Chiu, S., Williams, K. L. Bis-(3-allyl-4-hydroxyphenyl) sulfone decreases embryonic viability and alters hepatic mRNA expression at two distinct developmental stages in chicken embryos exposed via egg injection. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (2), 530-537 (2018).
- Franci, C. D., et al. Potency of polycyclic aromatic hydrocarbons in chicken and Japanese quail embryos. Environmental Toxicology and Chemistry. 37 (6), 1556-1564 (2018).
- Rand, M. D., et al. Developmental exposure to methylmercury and resultant muscle mercury accumulation and adult motor deficits in mice. Neurotoxicology. 81, 1-10 (2020).
- Tanaka, T., Suzuki, T., Inomata, A., Moriyasu, T. Combined effects of maternal exposure to fungicides on behavioral development in F1 -generation mice: 2. Fixed-dose study of thiabendazole. Birth Defects Research. , (2020).
- Kofman, O., Lan, A., Raykin, E., Zega, K., Brodski, C. Developmental and social deficits and enhanced sensitivity to prenatal chlorpyrifos in PON1-/- mouse pups and adults. PLoS One. 15 (9), 0239738 (2020).
- Kischel, A., Audouard, C., Fawal, M. A., Davy, A. Ephrin-B2 paces neuronal production in the developing neocortex. BMC Developmental Biology. 20 (1), 12 (2020).
- Okolo, F., Zhang, G., Rhodes, J., Gittes, G. K., Potoka, D. A. Intra-Amniotic Sildenafil Treatment Promotes Lung Growth and Attenuates Vascular Remodeling in an Experimental Model of Congenital Diaphragmatic Hernia. Fetal Diagnosis and Therapy. , 1-13 (2020).
- Vyslouzil, J., et al. Subchronic continuous inhalation exposure to zinc oxide nanoparticles induces pulmonary cell response in mice. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 61, 126511 (2020).
- Wahle, T., et al. Evaluation of neurological effects of cerium dioxide nanoparticles doped with different amounts of zirconium following inhalation exposure in mouse models of Alzheimer’s and vascular disease. Neurochemistry International. 138, 104755 (2020).
- Tanabe, K. Three-Dimensional Echocardiography- Role in Clinical Practice and Future Directions. Circ J. 84 (7), 1047-1054 (2020).
