Funktionell karakterisering av endogent uttryckta mänskliga RYR1-varianter
Summary
Här metoder som används för att studera den funktionella effekten av RYR1 mutationer endogent uttryckt i Epstein Barr Virus odödliggjorda mänskliga B-lymfocyter och muskel biopsi härledda satellitceller differentieras i myotubes beskrivs.
Abstract
Mer än 700 varianter i RYR1 genen har identifierats hos patienter med olika neuromuskulära störningar inklusive maligna hypertermi mottaglighet, kärna myopathies och centronuclear myopati. På grund av de olika fenotyper kopplade till RYR1 mutationer är det grundläggande att karakterisera deras funktionella effekter för att klassificera varianter som bärs av patienter för framtida terapeutiska interventioner och identifiera icke-patogena varianter. Många laboratorier har varit intresserade av att utveckla metoder för att funktionellt karakterisera RYR1-mutationer uttryckta i patienternas celler. Detta tillvägagångssätt har många fördelar, inklusive: mutationer uttrycks endogent, RyR1 är inte överexpresserad, användning av heterologous RyR1 uttrycker celler undviks. Men eftersom patienter kan presentera mutationer i olika gener bortsett från RYR1, är det viktigt att jämföra resultat från biologiskt material från individer som hyser samma mutation, med olika genetiska bakgrunder. Detta manuskript beskriver metoder som utvecklats för att studera de funktionella effekterna av endogent uttryckta RYR1-varianter i: a) Epstein Barr virus odödliggjorda mänskliga B-lymfocyter och (b) satellitceller som härrör från muskelbiopsier och differentieras i myotubes. Förändringar i den intracellulära kalciumkoncentrationen som utlöses av tillsats av farmakologiska RyR1-aktivatorer övervakas sedan. Den valda celltypen är laddad med en ratiometrisk fluorescerande kalciumindikator och intracellulära [Ca2+] förändringar övervakas antingen på encellig cellnivå genom fluorescensmikroskopi eller i cellpopulationer med hjälp av en spektrofluorometer. Vilo [Ca2+], agonist dosresponskurvor jämförs sedan mellan celler från friska kontroller och patienter som hyser RYR1-varianter som leder till insikt i den funktionella effekten av en given variant.
Introduction
Hittills har mer än 700 RYR1-varianter identifierats i den mänskliga populationen och kopplats till olika neuromuskulära störningar inklusive maligna hypertermikänslighet (MHS), motion inducerad rabdomyolys, central kärnsjukdom (CCD), multi-minicore sjukdom (MmD), centronukleär myopati (CNM)1,2,3 ; studier för att karakterisera deras funktionella effekter släpar efter och endast cirka 10% av mutationerna har testats funktionellt. Olika experimentella metoder kan användas för att bedöma effekten av en given RyR1-variant, inklusive transfektion av heterologa celler som HEK293 och COS-7 celler med plasmidkodning för WT och mutant RYR1 cDNA4,5,transduktion av dyspediska musfibblaster med plasmider och vektorer som kodar för WT och mutant RYR1 cDNA, följt av transduktion med myo-D och differentiering till myo-D och differentiering i my , generering av transgena djurmodeller som bär mutanta RyR1s7,8,9, karakterisering av celler från patienter som uttrycker RYR1-varianten endogent10,11,12. Sådana metoder har hjälpt till att fastställa hur olika mutationer funktionellt påverkar RyR1 Ca2 + kanalen.
Här beskrivs metoder som utvecklats för att bedöma de funktionella effekterna av RYR1 mutationer. Olika parametrar för intracellulära kalciumhomeostas undersöks i mänskliga celler endogent uttrycker RyR1 kalciumkanalen, inklusive myotubes och Epstein Barr Virus (EBV) odödliggjorda B-lymfocyter. Celler erhålls från patienter, expanderas i kultur och laddas med ratiometriska fluorescerande kalciumanklagare som Fura-2 eller indo-1. Parametrar som har rapporterats vara ändrade på grund av patogena RYR1-mutationer inklusive vilo [Ca2+], känsligheten för olika farmakologiska agonister och storleken på de intracellulära Ca2+ butikerna mäts antingen på encellig cellnivå, med hjälp av fluorescensmikroskopi eller i cellpopulationer med hjälp av en fluorimeter. Resultat som erhålls i celler från mutation bärare jämförs sedan med de som erhållits från friska kontroll familjemedlemmar. Detta tillvägagångssätt har visat att i) många mutationer kopplade till MHS leder till en ökning av vila [Ca2+] och en förskjutning till vänster i dosresponskurvan till antingen KCl-inducerad depolarisering eller farmakologisk RyR1-aktivering med 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; ii) Mutationer kopplade till CCD leder till en minskning av toppen [Ca2+] som frigörs genom farmakologisk aktivering av RyR1 och minskad storlek om den intracellulära Ca2+ lagrar12,13,14,15; iii) Vissa varianter påverkar inte Ca2+ homeostas13. Fördelarna med detta experimentella tillvägagångssätt är: RyR1-proteinet är inte över uttryckt och fysiologiska nivåer är närvarande, celler kan förevigas (både muskelceller och B-lymfocyter) som ger cellinjer som innehåller mutationer. Vissa nackdelar gäller det faktum att patienter kan bära mutationer i mer än en gen kodning proteiner som är involverade i kalcium homeostas och/eller excitation sammandragning koppling (ECC) och detta kan komplicera experimentella slutsatser. Till exempel identifierades två JP-45-varianter i MHS- och kontrollpopulationen och deras närvaro visade sig påverka känsligheten hos dihydropyridinreceptorn (DHPR) för aktivering16. Patienter måste vara tillgängliga, biologiskt material måste samlas in på nytt och etiska tillstånd måste erhållas från de lokala etiska nämnderna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som beskrivs i detta dokument har framgångsrikt använts av flera laboratorier för att studera effekten av RYR1 mutationer på kalciumhomeostas. De kritiska stegen i de tillvägagångssätt som beskrivs i detta dokument handlar om sterilitet, cellodlingsförmåga och tekniker och tillgänglighet av biologiskt material. I princip är användningen av EBV-odödliggjorda B-lymfocyter enklare och gör det möjligt att generera cellinjer som innehåller mutanta RyR1-kanaler. Cellerna kan frysas och lagras i flyt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arbetet som beskrivs i detta manuskript stöddes av bidrag från Swiss National Science Foundation (SNF) och Swiss Muscle Foundation.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
