Vi præsenterer en omfattende guide til fast mål prøve forberedelse, dataindsamling og databehandling til seriel synkrotron krystallografi på Diamond beamline I24.
Seriel dataindsamling er en relativt ny teknik til synkrotronbrugere. Diamond Light Source er en brugervejledning til indsamling af fast måldata på I24 og præsenteres for detaljerede trinvise instruktioner, tal og videoer, der gør det nemmere at få dataindsamling.
Seriel synkrotronkrystallografi (SSX) er en ny metode til dataindsamling, som er inspireret af røntgenfri elektronlasere (XFEL)1,2,3. Ved en XFEL registreres et enkelt diffraktionsmønster fra en normalt meget lille proteinkrystal, før krystallen ødelægges af den ekstremt lyse røntgenimpuls. Det betyder typisk, at en ny krystal skal indføres i røntgenstrålen for at opnå et andet diffraktionsmønster4. Dette behov for løbende at genopbygge krystaller har drevet udviklingen af mange serielle prøve leveringsteknikker5.
Ved synkrotroner anvendes klassiske (ikke-serielle) rotationskrystallografimetoder i vid udstrækning og udnytter en enkelt stor krystal, der roteres i en røntgenstråle ved hjælp af et goniometer til at indsamle et komplet datasæt til strukturopløsning6. For at øge levetiden af krystaller, så et komplet datasæt kan indsamles7,8, og også for at lette forsendelse og automatiseret prøveoverførsel, er krystaller cryocooled til ~ 100 K til dataindsamling. Ved intense mikrofokusstråler anvendes multikrystalstrategier ofte, da strålingsskader kan forbyde indsamling af et komplet datasæt fra en enkelt krystal9,10,11. På trods af de grænser, der er pålagt af strålingsskader, er antallet af anvendte krystaller relativt beskedent, og den anvendte fremgangsmåde er stort set identisk med enkeltkrystaleksperimentet.
SSX, på den anden side, bruger seriel prøve levering for at opnå enkelt stadig diffraktion mønstre fra tusindvis af tilfældigt orienterede krystaller til at generere en komplet datasæt. Det bemærkes, at serielle teknikker, der inkorporerer krystalrotation, er under udvikling12,13 selvom vi fokuserer på stadig nul rotation, tilgange. Der er en bred vifte af prøveleveringssystemer med forskellige fordele og ulemper14, lige fra at levere en strøm af krystaller i en strøm fokuseret / tyktflydende jet15,16,17, mikrofluidisk chip18,19eller krystaller på et fast mål som en ætset siliciumchip20,21 . Typisk holdes krystaller ved stuetemperatur, hvilket gør det muligt at observere større kropslig mangfoldighed og give et mere fysiologisk relevant miljø22. SSX gør det muligt at samle datasæt med meget lav dosis23, da den samlede dosis af datasættet svarer til en enkelt kort røntgeneksponering af en krystal. En anden stor fordel SSX giver, er studiet af protein dynamik gennem tid-løst metoder, med reaktioner udløst af udsættelse for laserlys24,25,26,27eller ved blanding af krystaller og ligand / substrat28,29. Ved hjælp af mindre krystaller betyder laserlys kan trænge ind i hele krystallen, ensartet indlede reaktionen uden multiphoton absorption til at give veldefinerede reaktion mellemprodukter for diffraktion data taget på forskellige tidspunkter27. Brug af større krystaller og rotationsbaserede dataindsamlingsmetoder lider af en begrænset laserindtrængningsdybde, nonuniform eller multiphoton aktivering, strålingsskader og mekanisk overhead tid inden for data sweeps, hvilket resulterer i en blanding af reaktion mellemprodukter, der kan vise sig vanskeligt eller umuligt at fortolke ved hurtigere reaktionshastigheder. Mindre krystaller giver en lignende fordel ved blanding af eksperimenter, da ligands hurtigt og mere ensartet kan diffusere i hele krystallen, hvilket igen gør det muligt at registrere definerede reaktions mellemprodukter på forskellige tidspunkter forsinkelser30,31,32.
På Diamond’s microfocus beamline I24 både konventionelle rotation og SSX eksperimenter kan udføres. Her præsenteres en omfattende protokol for SSX-prøveforberedelse og dataindsamling ved hjælp af faste mål på I24 og protokoller til dataanalyse af seriedata hos Diamond. Mens manuskriptet og de ledsagende videoer skal give brugerne mulighed for at udføre et vellykket SSX-eksperiment på I24, skal det bemærkes, at dette er et hurtigt udviklende felt, og tilgange udvikler sig hele tiden. Det skal også bemærkes, at serielle metoder er tilgængelige på andre synkrotronkilder, herunder, men ikke begrænset til, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI og PXII)34og NSLS (FMX)35. Mens detaljerne i seriel dataindsamling og -behandling vil variere fra kilde til kilde, vil de centrale principper forblive de samme. Protokollerne nedenfor skal ses som et udgangspunkt og en vej til base camp snarere end toppen af, hvad der kan opnås.
Denne protokol forudsætter, at brugerne har et protein- eller lille molekylekrystalsystem, hvorfra der er produceret en mikrokrystal gylle i størrelsesordenen 0,5-2,0 mL med en god tæthed af mikrokrystaller pr. ML. Protokoller for indhentning af krystallam er tidligere blevet beskrevet 36. Mange forskellige typer af faste mål er tilgængelige, den mest almindeligt anvendte på I24 udnytte en præcist defineret silicium chip. For at skelne fra andre chip layouts, under og i beamline interface dette kaldes en ‘Oxford chip’. Som tidligere beskrevet Oxford chip layout består af 8×8 ‘byblokke’, der hver indeholder 20×20 åbninger for i alt 25.600 åbninger20,21.
Seriel synkrotron dataindsamling er en relativt ny teknik på MX beamlines, der bygger bro mellem de ultrahurtige dataindsamlinger, der i øjeblikket udføres på XFELs og traditionel synkrotronbaseret MX. Dette manuskript har til formål at give et overblik over, hvordan man med succes indsamler fast mål seriedata på beamline I24, Diamond Light Source for lav dosis, dosis serie, og tid-løst eksperimenter. Som med standard krystallografi er prøveforberedelse en stor flaskehals i strukturopløsning. SSX er ikke anderledes, og fremstilling af en homogen krystal gylle i tilstrækkelige mængder har endnu ikke nydt godt af flere årtiers undersøgelse og raffinement som væksten af enkelte store proteinkrystaller har. Forberedelsen af disse gylle ligger imidlertid uden for dette dokuments anvendelsesområde og er blevet sammenfattet andetsteds36. Det kritiske trin i den tilgang, der er beskrevet her, indebærer omhyggelig brug af den tilgængelige prøve ved hjælp af brugervenlige GUI-grænseflader (trin 3) og automatiserede databehandlingspipeliner (trin 6) for at informere chippensning (trin 1), og hvordan et eksperiment skal fortsætte.
Den hurtige feedback pipeline er et kraftfuldt værktøj, der giver brugerne mulighed for at vurdere de første hithastigheder under dataindsamlingen for at informere efterfølgende chipindlæsningsprotokoller til vellykket dataindsamling. Når brugerne står over for en lav hitrate (<5%), risikerer de at indsamle ufuldstændige data og/eller spilde stråletid med yderligere samlinger. I dette tilfælde kan prøven samles, koncentreres ved skånsom centrifugering, og/eller større mængder kan lastes i trin 1.5. En højere hitrate er generelt gunstig, men der er et punkt med faldende afkast, hvor overbelastning fører til flere krystaller i samme brønd. DIALS er i stand til at håndtere multi-gitter diffraktion data50, men en større bekymring end indeksering og integration er den skadelige virkning krystal gruppering kan have på den selv aktivering af krystaller ved laserlys eller hurtig blanding for præcis tid løst eksperimenter. Der bør derfor udvises særlig omhu for at undgå overbelastning af faste mål for tidsfor løste forsøg.
Indekserings- og integrationsbehandlingstrinnet producerer et plot med det centrale kryds, der repræsenterer stråleretningen, hvert punkt, der repræsenterer retningen af hkl 001-refleksionen af individuelle gitter og den ydre ring af cirklen, der repræsenterer en rotation på 90 ° væk fra stråleaksen. Dette viser, om dine krystaller har en foretrukken retning, hvilket kan påvirke data fuldstændigheden og indikere behovet for at indsamle flere data eller variere indlæsningsprotokollen. I venstre panel af figur 7cvises effekten af overbelastning af en chip med HEWL-krystaller. Som åbninger fylde med flere krystaller, de holder sig til vinklet vægge af åbninger i stedet for wedging i bunden i en tilfældig orientering. De to ortogonale ellipser er et resultat af krystaller liggende på de indre vægge af chippen, som er på ~ 35 ° til strålen retning. Dette reducerer mængden af indlæste krystaller, reducerer hithastigheden og reducerer den fraktion af krystaller, der ligger i disse foretrukne planer, dramatisk.
Det skal bemærkes, at andre serielle tilgange er tilgængelige på I24, såsom LCP ekstrudere og mikrofluidiske chips. Disse bruger lignende GUIs og de samme forarbejdningsrørledninger, så meget af ovenstående vil forblive gældende, selvom der anvendes en anden teknik. Der findes en række serielle tilgange for både SSX og SFX ud over den faste målmetode, der er beskrevet her, hver har visse fordele i forhold til den anden afhængigt af det eksperiment, der skal udføres, og den strålelinje, der bruges til eksperimentet. Som serielle tilgange udvikler sig hurtigt er det tilrådeligt at kontrollere beamline websider (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) for de seneste opdateringer og tale med beamline personale på så tidligt som muligt, når du planlægger beamtime. Adgang til I24 for standard- og serieeksperimenter er gratis på brugsstedet. For britiske og EU-brugere dækkes rejse- og opholdsomkostningerne delvist gennem iNEXT Discovery.
Dette arbejde blev støttet af iNEXT-Discovery (Grant 871037), der blev finansieret af Horizon 2020-programmet fra Europa-Kommissionen.
Chip Holders | Custom Built | N/A | In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount. |
Chipless Chip Spacers | SWISCII | N/A | LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range |
Geobrick LV-IMS-II | Delta Tau | N/A | A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration |
Kinematic Mounts | ThorLabs | KB25/M | Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders. |
KNF Laboport Vacuum Pump | Merck | Z262285-1EA | Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed. |
Mylar Sheets 6 µm | Fisher Scientific | 15360562 | 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep |
Mylar Sheets 3 µm | Fisher Scientific | 04-675-4 | 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep |
Pelco easiGlow Glow Discharge System | Ted Pella, INC. | 91000 | A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces |
Silicon Chips | University of Southampton | N/A | Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes. |
Translation Stages | Smaract | N/A | XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution |
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) | 1byOne | B01DENO0EQ | Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier |