Vi presenterer en omfattende guide til klargjøring av faste målekseringer, datainnsamling og databehandling for seriell synkrotronkrystallografi ved Diamond beamline I24.
Seriell datainnsamling er en relativt ny teknikk for synkrotronbrukere. Diamond Light Source er en brukerhåndbok for innsamling av faste måldata på I24, og presenteres med detaljerte trinnvise instruksjoner, figurer og videoer for jevn datainnsamling.
Seriell synkrotronkrystallografi (SSX) er en ny metode for datainnsamling som ble inspirert av røntgenfrie elektronlasere (XFEL)1,2,3. Ved en XFEL registreres et enkelt diffraksjonsmønster fra en vanligvis veldig liten proteinkrystall, før krystallen ødelegges av den ekstremt lyse røntgenpulsen. Dette betyr vanligvis at en ny krystall må innføres i røntgenstrålen for å få et annet diffraksjonsmønster4. Dette behovet for å kontinuerlig etterfylle krystaller har drevet utviklingen av mange seriell prøveleveringsteknikker5.
Ved synkrotroner brukes klassiske (ikke-serielle) rotasjonskrystallografimetoder mye, og utnytter en enkelt stor krystall som roteres i en røntgenstråle ved hjelp av et goniometer for å samle et komplett datasett for strukturløsning6. For å øke levetiden til krystaller slik at et komplett datasett kan samles inn7,8, og også for å lette frakt og automatisert prøveoverføring, blir krystaller kryoolert til ~ 100 K for datainnsamling. Ved intense mikrofokusstråler brukes ofte multikrystallstrategier, da strålingsskader kan forby innsamling av et komplett datasett fra en enkelt krystall9,10,11. Til tross for grensene som pålegges av strålingsskader, forblir antall krystaller som brukes relativt beskjeden, og tilnærmingen som brukes er i hovedsak identisk med enkeltkrystalleksperimentet.
SSX bruker derimot seriell prøvelevering for å få enkle fortsatt diffraksjonsmønstre fra tusenvis av tilfeldig orienterte krystaller for å generere et komplett datasett. Det bemerkes at serielle teknikker som inkorporerer krystallrotasjon er under utvikling12,13 selv om vi fokuserer på still, null rotasjon, tilnærminger. Det finnes et bredt utvalg av prøveleveringssystemer med forskjellige fordeler og ulemper14, alt fra å levere en strøm av krystaller i en strømningsfokusert / viskøs jet15,16,17, mikrofluidisk chip18,19eller krystaller på et fast mål, for eksempel en etset silisiumbrikke20,21 . Vanligvis holdes krystaller ved romtemperatur, slik at større konformasjonsmangfold kan observeres og gir et mer fysiologisk relevant miljø22. SSX muliggjør innsamling av svært lave dosedatasett23, da den totale dosen av datasettet tilsvarer en enkelt kort røntgeneksponering av en krystall. En annen stor fordel SSX gir er studiet av proteindynamikk gjennom tidsløste metoder, med reaksjoner utløst av eksponering for laserlys24,25,26,27eller ved blanding av krystaller og ligand / substrat28,29. Bruk av mindre krystaller betyr at laserlys kan trenge inn i hele krystallen, og jevnt initiere reaksjonen uten multifotonabsorpsjon for å gi veldefinerte reaksjonsformidlere for diffraksjonsdata tatt på forskjelligetidspunkter 27. Bruk av større krystaller og rotasjonsbaserte datainnsamlingsmetoder lider av en begrenset lasergjennomtrengningsdybde, avviks- eller multifotonaktivering, strålingsskade og mekanisk overheadtid innen datasveiper, noe som resulterer i en blanding av reaksjonsforenkninger som kan vise seg vanskelig eller umulig å tolke ved raskere reaksjonshastigheter. Mindre krystaller gir en lignende fordel ved å blande eksperimenter, da ligander raskt og mer jevnt kan diffusere gjennom hele krystallen, slik at definerte reaksjonsforenkninger kan registreres på forskjellige tidspunkterforsinkelser 30,31,32.
Ved Diamonds mikrofokusstrålelinje I24 kan både konvensjonell rotasjon og SSX-eksperimenter utføres. Her presenteres en omfattende protokoll for SSX-prøveforberedelse og datainnsamling ved hjelp av faste mål på I24 og protokoller for dataanalyse av serielle data hos Diamond. Mens manuskriptet og tilhørende videoer skal tillate brukere å utføre et vellykket SSX-eksperiment på I24, bør det bemerkes at dette er et raskt utviklende felt og tilnærminger utvikler seg kontinuerlig. Det skal også bemerkes at serielle metoder er tilgjengelige ved andre synkrotronkilder, inkludert, men ikke begrenset til Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI og PXII)34og NSLS (FMX)35. Selv om spesifikasjonene for innsamling og behandling av serielle data vil variere mellom kilder, vil kjerneprinsippene forbli de samme. Protokollene nedenfor bør sees for å representere et utgangspunkt og en vei til baseleir i stedet for toppen av det som kan oppnås.
Denne protokollen antar at brukerne har et protein- eller lite molekylkrystallsystem, hvorfra en mikrokrystallslam på 0,5-2,0 ml med god tetthet av mikrokrystaller per ml er produsert. Protokoller for å skaffe krystallslam har blitt beskrevet tidligere 36. Mange forskjellige typer fast mål er tilgjengelige, de mest brukte på I24 bruker en presist definert silisiumbrikke. For å skille fra andre brikkeoppsett, under og i strålelinjegrensesnittet kalles dette en “Oxford-brikke”. Som tidligere beskrevet består Oxford-chipoppsettet av 8×8 “byblokker”, som hver inneholder 20×20 blenderåpninger for totalt 25 600 blenderåpninger20,21.
Seriell synkrotrondatainnsamling er en relativt ny teknikk ved MX-strålelinjer, som bygger bro mellom de ultraraske datainnsamlingene som for tiden utføres ved XFELer og tradisjonell synkrotronbasert MX. Dette manuskriptet tar sikte på å gi en oversikt over hvordan man lykkes med å samle inn seriedata med fast mål ved beamline I24, Diamond Light Source for lav dose, doseserier og tids løste eksperimenter. Som med standard krystallografi er prøvepreparering en stor flaskehals i strukturløsning. SSX er ikke annerledes, og tilberedning av en homogen krystallslam i tilstrekkelige mengder har ennå ikke hatt nytte av flere tiår med studier og raffinement som veksten av enkelt store proteinkrystaller har. Imidlertid er forberedelsen av disse slurries utenfor omfanget av dette papiret og har blitt oppsummert andre steder36. Det kritiske trinnet i tilnærmingen som er beskrevet her, innebærer nøye bruk av den tilgjengelige prøven ved hjelp av brukervennlige GUI-grensesnitt (trinn 3) og automatiserte databehandlingsforløp (trinn 6) for å informere brikkebelastningen (trinn 1) og hvordan et eksperiment skal fortsette.
Den raske tilbakemeldingspipeline er et kraftig verktøy som lar brukerne vurdere innledende trefffrekvenser under datainnsamling for å informere påfølgende brikkeinnlastingsprotokoller for vellykket datainnsamling. Når de står overfor en lav trefffrekvens (<5%), risikerer brukerne å samle ufullstendige data og / eller kaste bort stråletid med flere samlinger. I dette tilfellet kan prøven samles, konsentreres av skånsom sentrifugering, og/eller større volumer kan lastes inn i trinn 1.5. En høyere trefffrekvens er generelt gunstig, men det er et poeng med å redusere avkastningen der overbelastning fører til flere krystaller i samme brønn. DIALS er i stand til å håndtere multi-gitter diffraksjonsdata50, men en større bekymring enn indeksering og integrasjon er den skadelige effekten krystallgruppering kan ha på jevn aktivering av krystaller ved laserlys eller rask blanding for presis tid løst eksperimenter. Det bør derfor utvises særlig forsiktighet for å unngå overbelastning av faste mål for tids løste eksperimenter.
Indekserings- og integrasjonsbehandlingstrinnet produserer et plott med det sentrale korset som representerer stråleretningen, hvert punkt som representerer retningen til hkl 001-refleksjonen av individuelle gitter, og sirkelens ytre ring som representerer en rotasjon på 90 ° fra bjelkeaksen. Dette vil vise om krystallene dine har en foretrukket retning, noe som kan påvirke datafullhet og indikere behovet for å samle inn mer data eller variere lasteprotokollen. I panelet til venstre i figur 7cvises effekten av å overbelaste en brikke med HEWL-krystaller. Når blenderåpninger fylles med flere krystaller, holder de seg til de vinklede veggene i blenderåpningene i stedet for å luke ved foten i en tilfeldig retning. De to ortogonale ellipsene er et resultat av krystaller som ligger på brikkens indre vegger som er på ~ 35 ° til stråleretningen. Dette reduserer volumet av krystaller lastet, reduserer treffhastigheten, og reduserer dramatisk brøkdelen av krystaller som ligger i disse foretrukne planene.
Det skal bemerkes at andre serielle tilnærminger er tilgjengelige på I24, for eksempel LCP-ekstrudere og mikrofluidiske sjetonger. Disse bruker lignende GUIer, og de samme prosesseringsrørledningene så mye av det ovennevnte vil forbli aktuelt selv om en annen teknikk brukes. Det finnes en rekke serielle tilnærminger for både SSX og SFX utover den faste måltilnærmingen som er beskrevet her, hver har visse fordeler i forhold til den andre, avhengig av eksperimentet som skal utføres og strålelinjen som brukes til eksperimentet. Ettersom serielle tilnærminger utvikler seg raskt, anbefales det å sjekke beamline-nettsidene (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) for nylige oppdateringer og snakke med strålepersonell på et så tidlig stadium som mulig når du planlegger stråletid. Tilgang til I24 for standard- og serieeksperimenter er gratis ved bruk. For britiske og EU-brukere dekkes reise- og oppholdskostnader delvis gjennom iNEXT Discovery.
Dette arbeidet ble støttet av iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansiert av Horisont 2020-programmet til Europakommisjonen.
Chip Holders | Custom Built | N/A | In-house custom built metallic chip holders consisting of 2 magnetic base plates, 2 metal rings, and a kinematic mount. |
Chipless Chip Spacers | SWISCII | N/A | LCP adhesive sheets available as part of the LCP modular range |
Geobrick LV-IMS-II | Delta Tau | N/A | A multi-axis controller/amplifier with a custom Diamond Light Source hardware configuration |
Kinematic Mounts | ThorLabs | KB25/M | Square bases with 3 magnets arranged in a triangle affixed to chip holders. |
KNF Laboport Vacuum Pump | Merck | Z262285-1EA | Solid PTFE vauum pump, 10 l/min pumping speed. |
Mylar Sheets 6 µm | Fisher Scientific | 15360562 | 300 ft roll of 6 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep |
Mylar Sheets 3 µm | Fisher Scientific | 04-675-4 | 300 ft roll of 3 µm thick mylar XRF film by SPEX SamplePrep |
Pelco easiGlow Glow Discharge System | Ted Pella, INC. | 91000 | A compact stand alone glow discharge system used to produce hydrophillic surfaces |
Silicon Chips | University of Southampton | N/A | Custom etched silicon chips with 25,6000 apertures available in a variety of sizes. |
Translation Stages | Smaract | N/A | XYZ sample stages are a collaborative design by Diamond Light Source and SmarAct, custom-built by SmarAct using three linear translation 50mm travel stages, precise crossed roller guideways, and an integrated sensor with up to 1 nm resolution |
1byOne Humidifier (701UK-0003 ) | 1byOne | B01DENO0EQ | Commercially available 1.3 Litre ultrasonic humidifier |