रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मानव कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन और विस्तार
Summary
यहां, हम रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से मानव कार्डियोमायोसाइट्स को मजबूती से उत्पन्न करने और विस्तारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
एक ही रक्त ड्रा से रोगी विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स पैदा हृदय रोग पर सटीक दवा में जबरदस्त रुचि आकर्षित किया है । मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) से हृदय भेदभाव परिभाषित संकेत रास्ते है कि भ्रूण हृदय के विकास के लिए आवश्यक है द्वारा संग्राहक है । 2-डी और 3-डी प्लेटफार्मों पर कई हृदय भेदभाव विधियों को विभिन्न क्षमताओं और कार्डियोमायोसाइट उपज के साथ विकसित किया गया है। यह क्षेत्र के बाहर जांचकर्ताओं हैरान है के रूप में इन तरीकों की विविधता का पालन करने के लिए मुश्किल हो सकता है । यहां हम एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) से रोगी-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स की मजबूत पीढ़ी और विस्तार को विस्तृत करता है। हम पहले गैर-एकीकरण सेंडाइ वायरस वैक्टर का उपयोग करके रोगी के रक्त नमूने से एक उच्च दक्षता वाले आईपीएससी पुनर्प्रोग्रामिंग प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम तो विस्तार से एक छोटे से अणु मध्यस्थता मोनोलेयर भेदभाव विधि है कि मजबूती से सबसे मानव आईपीएससी लाइनों से धड़कन कार्डियोमायोसाइट्स का उत्पादन कर सकते हैं । इसके अलावा, एक स्केलेबल कार्डियोमायोसाइट विस्तार प्रोटोकॉल एक छोटे अणु (CHIR99021) का उपयोग करके पेश किया जाता है जो औद्योगिक और नैदानिक-ग्रेड अनुप्रयोगों के लिए रोगी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का तेजी से विस्तार कर सकता है। अंत में, इन आईपीएससी-सीएम के आणविक पहचान और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल चित्रित किए गए हैं। हम इस प्रोटोकॉल हृदय विकास और स्टेम सेल जीव विज्ञान पर सीमित ज्ञान के साथ शुरुआती लोगों के लिए व्यावहारिक होने की उम्मीद करते हैं।
Introduction
मानव प्रेरित पीएलयूरिपोटेंट स्टेम सेल की खोज ने आधुनिक हृदय चिकित्सा में क्रांति ला दी है1,2. मानव आईपीएससी हृदय में सभी कोशिका प्रकारों को आत्म-नवीनीकरण और उत्पन्न करने में सक्षम हैं, जिनमें कार्डियोमायोसाइट्स, एंडोथेलियल कोशिकाएं, चिकनी मांसपेशी कोशिकाएं और कार्डियक फाइब्रोब्लास्ट शामिल हैं। रोगी आईपीएससी-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (आईपीएससी-सीएम) आनुवंशिक रूप से विरासत में मिलने वाले हृदय रोगों (सीवीडी) मॉडलिंग और नईदवाओंके लिए हृदय सुरक्षा का परीक्षण करने के लिए अनिश्चित संसाधनों के रूप में काम कर सकते हैं। विशेष रूप से, रोगी आईपीएससी-सीएम सीवीडी के आनुवंशिक और आणविक इटियोलॉजी की जांच करने के लिए अच्छी तरह से तैयार हैं जो कार्डियोमायोसाइट्स में दोषों से प्राप्त होते हैं, जैसे लॉन्ग क्यूटी सिंड्रोम4 और डिलेटेड कार्डियोमायोपैथी (डीसीएम)5। CRISPR/Cas9-मध्यस्थता जीनोम संपादन के साथ संयुक्त, रोगी आईपीएससी-सीएम ने जन्मजात हृदय दोषों(CHDs)6,7,8सहित सीवीडी के जटिल आनुवंशिक आधार को समझने के लिए एक अभूतपूर्व अवसर खोला है । मानव आईपीएससी-सीएम ने दिल का दौरा पड़ने केदौरानक्षतिग्रस्त मायोकार्डियम की भरपाई के लिए ऑटोलॉगस सेल स्रोतों के रूप में सेवा करने की क्षमता भी प्रदर्शित की है । हाल के वर्षों में, कार्डियक पुनर्जनन और दवा परीक्षण10के लिए परिभाषित उपप्रकार (एट्रियल, वेंट्रिकुलर और नोडल) के साथ उच्च गुणवत्ता वाले मानव आईपीएससी-सीएम उत्पन्न करना सर्वोपरि हो गया है।
मानव आईपीएससी से हृदय भेदभाव पिछले एक दशक में बहुत उन्नत किया गया है । भ्रूणीय शरीर (ईबी) आधारित सहज भेदभाव से रासायनिक रूप से परिभाषित और निर्देशित हृदय भेदभाव11तक भेदभाव के तरीके चले गए हैं । मानव आईपीएससी10, 12से कार्डियोमायोसाइट भेदभाव को बढ़ाने के लिए भ्रूणीय हृदय विकास के लिए आवश्यक प्रमुख सिग्नलिंग अणुओं, जैसे डब्ल्यूएनटी,बीएमपी,नोडल और एफजीएफ में हेरफेर कियाजाताहै। महत्वपूर्ण अग्रिमों में मानव आईपीएससी13,14से कार्डियोमायोसाइट्स के मजबूत उत्पादन के लिए डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग (अवरोध के बाद सक्रियण) का अनुक्रमिक मॉड्यूलेशन शामिल है। रासायनिक रूप से परिभाषित हृदय विभेदन व्यंजनों का पता लगाया गया है ताकि कार्डियोमायोसाइट्स15, 16को मात देने के बड़े पैमाने पर उत्पादन को सुविधाजनक बनाया जा सके, जिसमें औद्योगिक और नैदानिक स्तर के उत्पादन में उन्नत होने की क्षमता है। इसके अलावा, प्रारंभिक मानव आईपीएससी-सीएम का मजबूत विस्तार एक छोटे रसायन (CHIR99021)17का उपयोग करके संविलियन डब्ल्यूएनटी सक्रियण के संपर्क में आने से प्राप्त होता है। हाल ही में, मानव आईपीएससी18, 19,20,21, 22से कार्डियोमायोसाइट वंश प्रतिबद्धता के दौरान विशिष्ट विभेदन खिड़कियों पर रेटिनोइक एसिड(आरए)और डब्ल्यूएनटी सिग्नलिंग रास्तों में हेरफेर के माध्यम से उपप्रकार-विशिष्ट कार्डियोमायोसाइट्स उत्पन्न होते हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम रोगी परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से निकलने वाले मानव सीएम की मजबूत पीढ़ी और प्रसार के लिए एक कार्य प्रक्रिया का विस्तार करते हैं। हम 1) के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं) मानव पीबीएमसी को आईपीएससी, 2) मानव आईपीएससी से धड़कने की मजबूत पीढ़ी, 3) प्रारंभिक आईपीएससी-सीएमएस का तेजी से विस्तार, 4) मानव आईपीएससी-सीएमएस का आणविक लक्षण वर्णन, और 5) मानव आईपीएससी-सीएमएस का इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल मापन पैच क्लैंप द्वारा एकल सेल स्तर पर। इस प्रोटोकॉल में रोगी रक्त कोशिकाओं को कार्डियोमायोसाइट्स की धड़कन में बदलने पर विस्तृत प्रायोगिक प्रक्रियाओं को शामिल किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग के दौरान, यह 1 सप्ताह के लिए संस्कृति पीबीएमसी के लिए महत्वपूर्ण है जब तक कि वे स्पष्ट नाभिक और साइटोप्लाज्म के साथ बढ़े हुए नहीं हैं। चूंकि पीबीएमसी पैदा नहीं होता है, इसलिए सफ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (एएचए) कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड 18CDA34110293 (एम-टी जेड), अतिरिक्त वेंचर्स एवीआईएफ और एसवीआरएफ पुरस्कार (एम-जेड), राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH/NHLBI) अनुदान 1R01HL124245 द्वारा समर्थित किया गया था, 1R01HL132520 और R01HL096962 (I.D.) । डॉ मिंग-ताओ झाओ को राष्ट्रव्यापी बाल अस्पताल में अबीगैल वेक्सनर रिसर्च इंस्टीट्यूट से स्टार्टअप फंड्स ने भी सपोर्ट किया ।
Materials
| ABI 7300 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | ||
| Axon Axopatch 200B Microelectrode Amplifier | Molecular Devices | Microelectrode Amplifier | |
| B27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| B27 supplement minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A1895601 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization solution, Perm/Wash buffer |
| BD Vacutainer CPT tube | BD Biosciences | 362753 | Blood cell separation tube |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific | A16517 | Sendai virus reprogramming kit |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | RNA extraction kit |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 media for iPSC culture |
| GlutaMAX supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-glutamine alternative |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 356231 | Basement membrane matrix |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | cDNA synthesis |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replacement (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | Molecular Devices | Electrophysiology data acquisition & analysis software | |
| Recombinant human EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| Recombinant human FLT3 | Thermo Fisher Scientific | PHC9414 | |
| Recombinant human IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| Recombinant human IL6 | Thermo Fisher Scientific | PHC0065 | |
| Recombinant human SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| RPMI 1640 medium, no glucose | Thermo Fisher Scientific | 11879020 | |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | Mounting media |
| StemPro-34 SFM | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | PBMC culture media |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444964 | qPCR master mix |
| TrypLE Select Enzyme 10x, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | A1217703 | CM dissociation solution |
| UltraPure 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | iPSC dissociation solution |
| Y-27632 2HCl | Selleck Chemicals | S1049 |
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