Osservare la funzione delle isole e le interazioni isolo-cellule immunitarie nelle fette di tessuto pancreatico vivo
Summary
Questo studio presenta l’applicazione di fette di tessuto pancreatico vivo allo studio della fisiologia delle isole e delle interazioni isolotto-cellula immunitaria.
Abstract
Le fette di tessuto pancreatico vivo consentono lo studio della fisiologia e della funzione delle isole nel contesto di un microambiente di isole intatte. Le fette sono preparate da tessuto pancreatico umano e di topo vivo incorporato nell’agarosio e tagliate usando un vibratoma. Questo metodo consente al tessuto di mantenere la vitalità e la funzione oltre a preservare patologie sottostanti come il diabete di tipo 1 (T1D) e di tipo 2 (T2D). Il metodo slice consente nuove direzioni nello studio del pancreas attraverso il mantenimento delle strutture complesse e delle varie interazioni intercellulari che comprendono i tessuti endocrini ed esocrini del pancreas. Questo protocollo dimostra come eseguire la colorazione e la microscopia time-lapse di cellule immunitarie endogene vive all’interno di fette pancreatiche insieme a valutazioni della fisiologia delle isole. Inoltre, questo approccio può essere perfezionato per discernere le popolazioni di cellule immunitarie specifiche per gli antigeni delle cellule insulari utilizzando i principali reagenti multimero complesso di istocompatibilità.
Introduction
Il coinvolgimento del pancreas è patognomonico a malattie come pancreatite, T1D e T2D1,2,3. Lo studio della funzione in isole isolate di solito comporta la rimozione delle isole dal loro ambiente circostante4. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo è stato sviluppato per consentire lo studio del tessuto pancreatico mantenendo intatti i microambienti delle isole ed evitando l’uso di stressanti procedure di isolamento delle isole5,6,7. Le fette di tessuto pancreatico da tessuto di donatore umano sono state utilizzate con successo per studiare il T1D e hanno dimostrato processi di perdita e disfunzione delle cellule beta oltre all’infiltrazione delle cellule immunitarie8,9,10,11,12,13. Il metodo della fetta di tessuto pancreatico vivo può essere applicato sia al tessuto pancreatico di topo che a quello umano5,6,8. Le fette di tessuto pancreatico umano da tessuti di donatori di organi sono ottenute attraverso una collaborazione con la Rete per i donatori di organi pancreatici con diabete (nPOD). Le fette di topo possono essere generate da una varietà di diversi ceppi di topo.
Questo protocollo si concentrerà sul gene-1-nullo attivante la ricombinazione diabetica non obesa (NOD). Rag1-/-) e il recettore delle cellule T transgenico (AI4) (NOD. Rag1-/-. Ceppi di topo AI4 α/β). ANNUIRE. I topi Rag1-/- non sono in grado di sviluppare cellule T e B a causa di un’interruzione del gene 1 (Rag1)14 che attiva la ricombinazione. ANNUIRE. Rag1-/-. I topi AI4 α/β sono utilizzati come modello per il diabete di tipo 1 accelerato perché producono un singolo clone di cellule T che prende di mira un epitopo di insulina, con conseguente infiltrazione costante delle isole e rapido sviluppo della malattia15. Il protocollo qui descritto descrive le procedure per studi funzionali e immunologici che utilizzano fette pancreatiche umane e di topo vive attraverso l’applicazione di approcci di microscopia confocale. Le tecniche qui descritte includono valutazioni di vitalità, identificazione e localizzazione delle isole, registrazioni citosoliche di Ca2+ , nonché colorazione e identificazione delle popolazioni di cellule immunitarie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo di questo protocollo è quello di spiegare la generazione di fette di pancreas e le procedure necessarie per impiegare le fette in studi funzionali e immunologici. Ci sono molti vantaggi nell’uso di fette pancreatiche vive. Tuttavia, ci sono diversi passaggi critici che sono essenziali affinché il tessuto rimanga vitale e utile durante i protocolli di esperimento descritti. È imperativo lavorare rapidamente. Il periodo di tempo tra l’iniezione del pancreas e la generazione delle fette sul vibratoma dovrebbe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalle sovvenzioni NIH R01 DK123292, T32 DK108736, UC4 DK104194, UG3 DK122638 e P01 AI042288. Questa ricerca è stata condotta con il supporto del Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes (nPOD; RRID: SCR_014641), un progetto collaborativo di ricerca sul diabete di tipo 1 sponsorizzato da JDRF (nPOD: 5-SRA-2018-557-Q-R) e The Leona M. & Harry B. Helmsley Charitable Trust (Grant #2018PG-T1D053). Il contenuto e le opinioni espresse sono responsabilità degli autori e non riflettono necessariamente il punto di vista ufficiale di nPOD. Le organizzazioni di approvvigionamento di organi (OPO) che collaborano con nPOD per fornire risorse di ricerca sono elencate in http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/. Grazie al Dr. Kevin Otto, Università della Florida, per aver fornito il vibratoma utilizzato per generare fette di mouse.
Materials
| #3 Style Scalpel Handle | Fisherbrand | 12-000-163 | |
| 1 M HEPES | Fisher Scientific | BP299-100 | HEPES Buffer, 1M Solution |
| 10 cm Untreated Culture Dish | Corning | 430591 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | BD | 301029 | BD Syringe with Luer-Lok Tips |
| 27 G Needle | BD | BD 305109 | BD General Use and PrecisionGlide Hypodermic Needles |
| 35 mm coverglass-bottom Petri dish | Ibidi | 81156 | µ-Dish 35 mm, high |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 8-well chambered coverglass | Ibidi | 80826 | µ-Slide 8 Well |
| APC anti-mouse CD8a antibody | Biolegend | 100712 | |
| BSA | Fisher Scientific | 199898 | |
| Calcium chloride | Sigma | C5670 | CaCl2 |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C7902 | CaCl2 (dihydrate) |
| Compact Digital Rocker | Thermo Fisher Scientific | 88880020 | |
| Confocal laser-scanning microscope | Leica | SP8 | Pinhole = 1.5-2 airy units; acquired with 10x/0.40 numerical aperture HC PL APO CS2 dry and 20x/0.75 numerical aperture HC PL APO CS2 dry objectives at 512 × 512 pixel resolution |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | C6H12O6 |
| ddiH2O | |||
| Dithizone | Sigma-Aldrich | D5130-10G | |
| DMSO | Invitrogen | D12345 | Dimethyl sulfoxide |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2805 | |
| Falcon 35 mm tissue culture dish | Corning | 353001 | Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes |
| FBS | Gibco | 10082147 | |
| Feather No. 10 Surgical Blade | Electron Microscopy Sciences | 7204410 | |
| fluo-4-AM | Invitrogen | F14201 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Gel Control Super Glue | Loctite | 45198 | |
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11049-10 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| HBSS | Gibco | 14025092 | Hanks Balanced Salt Solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | C8H18N2O4S |
| Ice bucket | Fisherbrand | 03-395-150 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-05 | |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Roboz Surgical Store | RS-7440 | Straight; 500-900 Grams Pressure; 1.5" Length |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34705 | Kimtech Science™ Kimwipes™ Delicate Task Wipers, 2-Ply |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L3224 | This kit contains the calcein-AM live cell dye. |
| Low glucose DMEM | Corning | 10-014-CV | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | MgCl2 (hexahydrate) |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma | M2773 | MgSO4 (heptahydrate) |
| Magnetic Heated Platform | Warner Instruments | PM-1 | Platform for imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Microwave | GE | JES1460DSWW | |
| Nalgene Syringe Filter | Thermo Fisher Scientific | 726-2520 | |
| No.4 Paintbrush | Michaels | 10269140 | |
| Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | Imaging chamber for dynamic stimulation recordings |
| Oregon Green 488 BAPTA-1-AM | Invitrogen | O6807 | cell-permeable Ca2+ indicator |
| Overnight imaging chamber | Okolab | H201-LG | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 20012050 | To make agarose for slice generation |
| PE-labeled insulin tetramer | Emory Tetramer Research Core | sequence YAIENYLEL | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | KCl |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | KH2PO4 |
| Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 71998 | For Vibratome; Double Edge Stainless Steel, uncoated |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| SeaPlaque low melting-point agarose | Lonza | 50101 | To make agarose for slice generation |
| Slice anchor | Warner Instruments | 64-1421 | |
| Slice anchor (dynamic imaging) | Warner Instruments | 640253 | Slice anchor for dynamic imaging chamber |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | NaCl |
| Sodium phosphate monohydrate | Sigma | S9638 | NaH2PO4 (monohydrate) |
| Soybean Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) |
| Stage Adapter | Warner Instruments | SA-20MW-AL | To fit imaging chamber for dynamic stimulation recordings on the microscope stage |
| Stage-top incubator | Okolab | H201 | |
| Stereoscope | Leica | IC90 E MSV266 | |
| SYTOX Blue Dead Cell Stain | Invitrogen | S34857 | blue-fluorescent nucleic acid stain |
| Transfer Pipet | Falcon | 357575 | Falcon™ Plastic Disposable Transfer Pipets |
| Valve Control System | Warner Instruments | VCS-8 | System for dynamic stimulation recordings |
| Vibratome VT1000 S | Leica | VT1000 S | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD02 | Fisherbrand Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath GPD 02 |
References
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