Krystallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin udføres ved hjælp af en arbejdsgang med dedikerede sammensatte biblioteker, krystalhåndteringsværktøjer, hurtige dataindsamlingsfaciliteter og stort set automatiseret dataanalyse. Den fremlagte protokol har til formål at maksimere produktionen af sådanne eksperimenter for at give lovende udgangspunkter for downstream strukturbaseret ligand design.
Fragment screening er en teknik, der hjælper med at identificere lovende udgangspunkter for ligand design. I betragtning af at krystaller af målproteinet er tilgængelige og viser reproducerbart røntgendiffraktionsegenskaber i høj opløsning, er krystallografi blandt de mest foretrukne metoder til fragmentscreening på grund af dets følsomhed. Derudover er det den eneste metode, der giver detaljerede 3D-oplysninger om fragmentets bindingsmåde, hvilket er afgørende for efterfølgende rationel sammensatte udvikling. Den rutinemæssige brug af metoden afhænger af tilgængeligheden af egnede fragmentbiblioteker, dedikerede midler til at håndtere et stort antal prøver, state-of-the-art synkrotronstrålelinjer til hurtige diffraktionsmålinger og stort set automatiserede løsninger til analyse af resultaterne.
Her præsenteres den komplette praktiske arbejdsgang og de medfølgende værktøjer til, hvordan man udfører krystallografisk fragmentscreening (CFS) på Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Forud for denne arbejdsgang er krystalblødningsforhold samt dataindsamlingsstrategier optimeret til reproducerbare krystallografiske eksperimenter. Derefter, typisk i en en til to-dages procedure, anvendes et 96-medlem CFS-fokuseret bibliotek, der leveres som tørrede brugsklare plader, til at suge 192 krystaller, som derefter flashkøles individuelt. De endelige diffraktionseksperimenter kan udføres inden for en dag ved de robotmonteringsunderstøttede bjælkelinjer BL14.1 og BL14.2 ved BESSY II elektronopbevaringsringen, der drives af HZB i Berlin-Adlershof (Tyskland). Behandling af de krystallografiske data, raffinement af proteinstrukturerne og hitidentifikation er hurtig og stort set automatiseret ved hjælp af specialiserede softwarerørledninger på dedikerede servere, der kræver lidt brugerinput.
Brug af CFS-arbejdsgangen på HZB muliggør rutinemæssige screeningseksperimenter. Det øger chancerne for en vellykket identifikation af fragment hits som udgangspunkt for at udvikle mere potente bindemidler, nyttige for farmakologiske eller biokemiske applikationer.
Det første skridt i udviklingen af lægemidler er screening af forbindelser mod et mål af interesse. Traditionelt anvendes store sammensatte biblioteker i størrelsesordenen 100.000-1.000.000 poster i biokemiske højoverførselsanalyser i den farmaceutiske industri. Denne strategi blev suppleret med fragment-baseret drug design (FBDD), en nyere metode, der tog en kraftig stigning i løbet af de sidste 20 år og blev en mainstream strategi for at generere høj kvalitet bly kandidater på grund af flere iboende fordele ved metoden1. Udtrykket “fragment” refererer til et lille organisk molekyle, der typisk indeholder mindre end 20 ikke-hydrogen eller tunge atomer (HAs). Således er et fragment betydeligt mindre end de lægemiddel- eller blylignende molekyler (normalt mindre end 30 HAs), der undersøges i konventionel højoverførselshastighedsscreening. Fragmenter er svage affinitetsbind. Sammenlignet med større molekyler er fragmenter imidlertid mere alsidige, da selv en lille samling af dem bedre kan repræsentere det respektive kemiske rum af molekyler af samme størrelse2. Også, udviklende fragment screening hits i bly molekyler er betydeligt mere effektiv end at optimere allerede større molekyler2,3,4,5. Det betyder, at screening af fragmenter, indtil påvisningen er tilstrækkelig følsom, kan anvendes effektivt og giver udgangspunkter af høj kvalitet for yderligere udvikling af forbindelser. Flere biofysiske metoder kan anvendes til fragmentscreening, den mest populære er nuklear magnetisk resonans, røntgenkrystallografi, overfladeplasmonresonans og termiske skiftanalyser. Disse metoder anvendes enten parallelt eller sekventielt med det formål at øge tilliden til hits og reducere antallet af falske positiver eller falske negativer. En nyligt gennemført sammenlignende undersøgelse6 tydede imidlertid på, at sekventielle screeningkaskader skal undgås på grund af den lave overlapning mellem de forskellige metoder.
Røntgenkrystallografi er en veletableret metode til strukturbestemmelse ved atomdetaljer , men er for nylig også blevet udviklet som et redskab til screeningsformål7,8. Da proteinkrystaller tolererer høje fragmentkoncentrationer (f.eks. 100 mM), kan krystallografisk fragmentscreening (CFS) konkurrere med andre biofysiske metoder til screening af fragmenter eller endda udkonkurrere dem som en førstetrinsscreeningsmetode6,9. En vigtig forudsætning for CFS er imidlertid et valideret krystalliseringssystem af målproteinet, der reproducerbart leverer krystaller med diffraktionsegenskaber til betydeligt høj opløsning, typisk bedre end 2 Å.
En eksklusiv fordel ved CFS sammenlignet med alle andre fragmenteringsscreeningsmetoder er tilvejebringelse af detaljerede 3D-oplysninger om bindingsmåden for de identificerede fragmenter. Disse strukturelle oplysninger er helt afgørende for den rationelle optimering af fragmentet hits til højere affinitet bindemidler. Etablerede udarbejdelsesstrategier vokser, fusionerer og forbinder fragment hits5. Derved leveres der relativt høj ligandeffektivitet fra starten, og indførelsen af unødvendige eller rumligt ikke egnede grupper kan undgås, hvilket reducerer omkostningerne ved kemisk syntese. Alt i alt har CFS uovertruffen fordele som en startstrategi for lægemiddeldesign.
I betragtning af at et bestemt biologisk mål opfylder de høje krav i CFS med hensyn til krystalkvalitet, er der nogle hovedfaktorer, der maksimerer chancerne for et vellykket resultat af sådanne screeningskampagner. Det afhænger af kvaliteten af det anvendte fragmentbibliotek, af en effektiv arbejdsgang til at udføre eksperimenterne før diffraktionseksperimentet, af synkrotronstrålelinjer med tilstrækkelig automatisering og dataindsamlingshastighed samt af måder og midler til stort set automatiseret databehandling og analyse. Her præsenteres den komplette arbejdsgang fra krystalblødningseksperimenter til hitidentifikationen på den måde, den med succes etableres på de makromolekylære krystallografistrålelinjer ved BESSY II (Figur 1). Faciliteten er åben for akademiske og industrielle brugere til samarbejde. Derudover kan akademiske brugere af EU-lande uden for Tyskland nemt ansøge om finansiering via iNEXT Discovery-projektet.
Der er uundværlige forudsætninger for at kunne starte en CFS-kampagne og gennemføre den protokol, der er skitseret i dette arbejde: veldrifferende krystaller af målproteinet er tilgængelige, der kan reproduceres i stort antal, der er stabile ved omgivelsestemperatur, og som blev dyrket ved hjælp af en krystalliseringscocktail uden meget flygtige ingredienser. En anden forudsætning er krystalgitterets egnethed til eksperimentet. I et passende gitter skal målproteinets interessante steder udsættes for opløsningsmiddelkanalerne og dermed tilgængelige. Et andet foregående trin, der er valgfrit, men ikke desto mindre stærkt anbefales for at sikre succes i arbejdsgangen i CFS-kampagnen, er optimeringen af blødgøringstilstanden for eksperimentet. Vitale benchmarkstatistikker her er krystallens diffraktionskraft og de relevante datakvalitetsindikatorer, som bestemmes under dataskaleringsproceduren. Typiske faktorer, der skal optimeres, er DMSO-tolerance, bufferkoncentration og kryobeskyttende. Selvom det ikke er en streng forudsætning som yderligere beskrevet nedenfor, kan DMSO som et co-solvent bidrage til at øge fragmentopløseligheden. Typiske test bør omfatte iblødsætning af 0, 3, 6 eller 10% (v/ v) DMSO natten over. En forøgelse af bufferkoncentrationen til 200 eller 300 mM bidrager til at forhindre tab af diffraktionskvalitet som følge af lejlighedsvise pH-skiftende virkninger som følge af de høje fragmentkoncentrationer, der skal anvendes. Endelig er det afgørende at finde ud af, om og hvilke yderligere kryobeskyttende middel der er behov for, og om det allerede kan indgå i blødgøringstilstanden. I mange tilfælde er der imidlertid ikke behov for en ekstra kryo-protectant, fordi DMSO selv kan fungere som kryobeskyttende middel. Hvis det er tilfældet, sparer dette et håndteringstrin i det endelige eksperiment. De fleste krystaller har brug for mindre kryo-protectant, hvis flash-afkølet på passende størrelse sløjfer, minimere eller undgå omkringliggende moderlud så meget som muligt. Men i sjældne tilfælde er et lag af moderluden faktisk nødvendigt for at forhindre skader på krystallen ved flashkøling.
Antallet af hits opnået i en CFS-kampagne afhænger ikke kun af målproteinets lægemiddelgabilitet og krystalgitterets egnethed (se ovenfor), men det afhænger også af bibliotekets kvalitet. Bibliotekets kvalitet omfatter to aspekter: udvælgelsen af forbindelser til biblioteket og konfekture af forbindelserne (dvs. i hvilken fysisk form de præsenteres for eksperimentet). For sammensat udvælgelse forskellige strategier kan anvendes. De fleste biblioteksdesign omfatter maksimering af fragmenternes kemiske mangfoldighed. Et strategisk fokus kunne være at inkludere den kemiske tractability af fragmenter til opfølgende design, som er blevet anvendt for eksempel i Diamond-SGC-iNEXT klar bibliotek10. Endnu et strategisk fokus for biblioteksdesign kunne være at maksimere repræsentationen af kommercielt tilgængelige kemiske rum af fragmenter ved form- og farmakophorebaseret klyngedannelse, som det er blevet eksemplificeret ved F2X-bibliotekerne udviklet på HZB11. Mere specifikt er det 1103-medlemmer F2X-Universal Library og repræsentative 96-sammensatte delmængde til indledende CFS-kampagner, der kaldes F2X-Entry Screen, blevet udviklet, og F2X-Entry Screen er blevet valideret med succes11. F2X-Entry Screen er det primære valg til CFS-kampagner på HZB. Derefter kan større kampagner derefter gennemføres ved hjælp af F2X-Universal Library eller det 1056-medlemmer EU-OPENSCREEN fragment bibliotek12, der også tilbydes på HZB. På nuværende tidspunkt er disse biblioteker gratis tilgængelige for brugere af de makromolekylære krystallografistrålelinjer i BESSY II-synkrotronen i Berlin på grundlag af en samarbejdskontrakt. Det gælder også for brugere via iNEXT Discovery forslag. Desuden er F2X-Entry Screen tilgængelig for alle interesserede forskere på grundlag af en materialeoverførselsaftale.
Med hensyn til den fysiske præsentation af et bibliotek er der almindeligt anvendt to fremgangsmåder: fragmenterne anvendes enten som DMSO-stamopløsninger, eller fragmenterne tørres og immobiliseres på brugsklare plader. På HZB, både F2X-Entry Screen og ikke-flygtige forbindelser af F2X-Universal Library præsenteres som tørrede-on forbindelser i en 3-linse 96-godt MRC lav profil krystallisering plade. Præsentationen af fragmenter immobiliseret i krystallisering plader har to vitale fordele: For det første, det giver mulighed for transport af screening plader til brugerens hjem lab. Derfor kan blødgørings- og krystalhåndteringstrinnene i den arbejdsgang, der præsenteres her (trin 1-3), udføres overalt. For det andet kan DMSO-fri løsning anvendes. DMSO-følsomme mål kan således let screenes , hvilket stort set bevarer de forventede hitrater11. DMSO øger imidlertid fragmentopløseligheden, og det er derfor værd at kontrollere DMSO-tolerancen for et krystalsystem efter eget valg på forhånd som skitseret ovenfor.
Den protokol, der er skitseret nedenfor, vil beskrive et typisk eksperiment med en 96-sammensat skærm, såsom F2X-Entry Screen. Til det skal ca. 250 krystaller fremstilles i tide til at blive brugt frisk. Det er meget tilrådeligt at forberede opsuger til alle 96 forbindelser i to eksemplarer. Det anbefales, men valgfrit, at forberede yderligere mock-soaks, der senere vil hjælpe med dataanalyse ved hjælp af PanDDA-tilgangen (pan-data density analysis) til hitidentifikation13. Mock-soaks defineres som iblødsætningseksperimenter på proteinkrystaller ved hjælp af den samme blødgøringsopløsning som fragmentet opsuger i samme inkubationstid, men der er ingen fragmenter til stede. Hvis blødgøringsopløsningen er lig med krystalliseringstilstanden, kan krystallerne høstes direkte fra krystalliseringspladen.
Afhængigt af robotprøveskifterens egenskaber kan det være nødt til at bruge forskellige puckformater. I øjeblikket skal prøver til den HZB-opererede strålelinje BL14.1 fremstilles i Unipuck-format, prøver til den HZB-opererede strålelinje BL14.2 skal fremstilles i SPINE puck-format. I denne protokol antages forberedelse i Unipuck-format.
For en vellykket CFS-kampagne er det vigtigt at overholde de beskrevne forudsætninger (se Introduktion). Et pålideligt krystalliseringssystem er nødvendigt for reproducerbar vækst af mange veldiffrerende krystaller, og der er behov for en velforfinet struktur som input apo-model til automatiseret raffinement. Det er også vigtigt at kontrollere, at målstedet på proteinet (aktivt sted eller grænsefladeområde) er tilgængeligt for fragmenter i krystalgitteret. Det er vigtigt at optimere blødgøringsbetingelserne på forhånd for at sikre, at blødningen ikke forringes væsentligt krystalkvaliteten. Forsømmelse af disse aspekter vil højst sandsynligt føre til et suboptimalt eksperiment, som vil være af begrænset brug og i værste fald vil kræve en gentagelse af hele eksperimentet.
Den protokol, der er beskrevet ovenfor, skitserer de procedurer, der følges under en standard CFS-kampagne. Hvis alle forudsætninger er opfyldt, skal mindst 90% af alle gennemblødte krystaller vise diffraktion til høj opløsning i et diffraktionseksperiment. Hvis dette ikke er tilfældet, kan blødgøringstiderne forkortes til et par timer eller endda minutter. På grund af den gode opløselighed i de fleste fragmenter skulle dette være tilstrækkeligt til at opnå anstændige belægningsværdier. En typisk CFS-kampagne vil også resultere i et hit på ca. 10% eller derover. For F2X-EntryScreen-valideringskampagnerne 11 og igangværende brugerkampagner med det samme bibliotek er der observeret endnu højere hitrater (20% og derover, data vises ikke).
En generel advarsel om krystallografisk fragmentscreening er tilstedeværelsen af krystallografiske kontaktsteder. Disse kunne enten occlude a priori kendte aktive steder (der skal kontrolleres før screeningen, se ovenfor), eller disse kontakt sites også ofte giver lommer og hot spots, hvor fragmenter kan binde. Sådanne fragment hits vil være artefakter af krystallisering gitter og vil sandsynligvis ikke binde sig til proteinet i opløsning. Disse hændelser har tendens til at forekomme oftere i iblødsætning eksperimenter end i co-krystallisering eksperimenter (sandsynligvis på grund af de højere fragmentkoncentrationer ansat i iblødsætning eksperimenter). Ifølge tidligere erfaringer udgør de dog generelt kun en mindre del af de opnåede hits. For eksempel i F2X-Entry Screen validering kampagne ved hjælp af endothiapepsin (EP) og splejset protein-protein kompleks af Prp8RNaseH og Aar2 (AR), de fleste af de hits fandt sted i lovende steder11. For EP var 27 ud af de 37 observerede bindingshændelser placeret på det aktive sted (dvs. peptidspalten i denne protease). De 10 fjernbindingshændelser omfatter to solventudsatte bindingshændelser og otte krystalkontaktbindingshændelser (svarende til fem unikke hits). Hvis man ser bort fra disse krystalkontakthits, vil det stadig afspejle en samlet sats på 24 % unikke hits for EP-kampagnen. Det er også vigtigt at bemærke, at bindingshændelser, der ligger fjernt fra et kendt aktivt sted (undtagen krystalkontaktbind), også potentielt kan være interessante (f.eks. afslørende nye hot spots eller allosteriske steder af proteinet). For AR-kampagnen (i samme publikation) af de 23 observerede bindingshændelser var syv placeret ved krystalkontakter, den ene var placeret på den direkte grænseflade mellem de to proteiner, syv var placeret på kendte proteinproteininteraktionssteder med andre bindende partnere i den større biologiske kontekst (dermed forskellige samlingsstadier af splejsning), otte bindende begivenheder afslørede to hot spots på AR af endnu ukendt funktion og den ene var på en opløsningsmiddel eksponeret overflade Prp8RnaseH. Derfor, bortset fra begivenhederne på krystal kontakter og Prp8RnaseH singleton, antallet af potentielt nyttige bindende begivenheder er 15 (svarende til 14 unikke hits) og dermed et hit på 15,6%. Disse hits kan være udgangspunkter for design af protein-protein interaktion modulatorer eller for værktøj forbindelser med henblik på at udforske de to opdagede Aar2 hot spots. Samlet set, også i overensstemmelse med gennemførte brugerkampagner, ofte kun en mindre del af hits i krystallografisk fragment screening skal ses bort fra som artefakter. Dette vil dog også i høj grad være afhængigt af mål.
Hvis hitraten er betydeligt lavere, kan dette indikere et af følgende problemer relateret til målproteinet. For eksempel blev der i en CFS-kampagne mod en viral cysteinprotease kun observeret et hit på kun 3% (data vises ikke). Det viste sig, at det anvendte protein sandsynligvis blev kemisk modificeret på dets aktive sted. I et sådant tilfælde kan et andet proteinpræparat løse problemet. Hvis krystaller er meget DMSO intolerante, F2X-Entry Screen kan også bruges uden DMSO, selv om resultaterne kan variere til en vis grad. De fleste af de hits opnået i overværelse af DMSO vil også dukke op i sit fravær. Der vil også være nogle hits, der ikke kan observeres i mangel af DMSO, selv om de kan observeres i sin tilstedeværelse. Og endelig vil der være nogle, der kun dukker op i mangel af DMSO.
Den alvorligste vanskelighed opstår, hvis proteinet undergår en induceret-fit bevægelse på stofbinding. Mest sandsynligt vil krystalgitteret ikke tolerere proteinbevægelsen, og krystallerne vil gå i opløsning. I et sådant tilfælde er det eneste valg at ty til co-krystallisering af proteinet og fragmenterne. Dette kan dog føre til nye krystalformer. Derfor vil meget af automatiseringen af hele processen ikke fungere effektivt længere. Heldigvis er der i de fleste CFS-kampagner, der er gennemført på HZB indtil videre, ikke stødt på denne type problemer. Det kan være, at den svage binding af et fragment, ikke giver nok energi til at fremkalde en proteinbevægelse, især hvis den krystalliserede kropsbygning stabiliseres af krystalemballeringskræfter.
En anden alvorlig begrænsning af den metode, som forfatterne er stødt på indtil videre, er, når krystalliseringscocktailen (og dermed blødgøringsopløsningen) indeholder flygtige forbindelser. Så bliver det tæt på umuligt at udføre al krystalhåndtering på en meningsfuld måde.
Forskellige proteiner kan indeholde druggable steder i større eller mindre grad. For eksempel formidles proteinproteininteraktioner normalt af udvidede flade overflader, der er vanskeligere at målrette mod. Den fragmentbindings hitrate vil derfor sandsynligvis afhænge af strukturen af proteinets molekylære overflade. I ekstreme tilfælde indeholder et protein muligvis ikke nogen egnede overflade hot spots, der tjener som målsteder for fragmentbinding. På trods af et omhyggeligt udført eksperiment vil der således ikke opstå fragmenterede hits fra screeningen. Forfatterne har imidlertid hidtil ikke stødt på en sådan situation.
I princippet kan krystalblødningen og høstdelen af en CFS-kampagne ved hjælp af den ovenfor beskrevne protokol udføres i ethvert laboratorium, der er udstyret til krystalhåndtering. Dette adskiller metoden på HZB fra andre CFS-faciliteter og kan i nogle tilfælde være en fordel. Hvis krystallerne f.eks. ikke let kan genproduceres på et andet sted, eller hvis forsøgsfolkenes rejse er begrænset (f.eks. i en verdensomspændende pandemisituation), er brugerne på HZB derfor udstyret med hele udstyret (pucke, værktøjer, EasyAccess Frame, prøveholdere osv.) som et transportabelt sæt.
Kravene til et stort antal prøveholdere og kryogene lagerkapaciteter opfyldes dog endnu mere bekvemt på dedikerede CFS-faciliteter. Desuden er behovet for indsamling af mange diffraktionsdatasæt stærkt fortalere for at lokalisere disse faciliteter tæt på bjælkelinjer, der er rettet mod en høj prøveoverførselshastighed. Eksempler herpå er beamlines I04-1 ved Diamond Light Source og den tilhørende XChem-facilitet i UK8,25, MASSIF-strålelinerne ved ESRF i France26 eller FragMAX-anlægget ved BioMAX-strålelinjen ved MAX IV i Sverige18.
I fremtiden kunne det forestille sig at designe CFS-eksperimenter uden behov for krystalhåndtering helt. De første fremskridt i denne retning er blevet rapporteret. F.eks. ved akustisk væskeoverførsel, der gør det muligt at blande både de krystalholdige opløsninger og fragmentopløsningerne direkte på prøveholdere af masketypen27. En anden tilgang blev brugt til XFEL-baserede ligand-screening. I et proof-of-principle eksperiment blev der fremstillet en krystalslam i batch, og iblødsætning og diffraktion dataindsamling blev udført på en silicium fast målchip28. Disse tilgange er dog stadig under udvikling og kan langt fra anvendes på en lang række proteinmål eller er mulige for CFS-faciliteter som rutine.
Med protokollen i dette arbejde detaljerede instruktioner til at udføre CFS-kampagner ligetil på HZB (og andre steder) er blevet skitseret og generel vejledning og nyttige hands-on tips til at forberede og gennemføre sådanne eksperimenter med større chancer for succes er blevet givet. I sidste ende bidrager bedre odds og succesrater i CFS-screening i vid udstrækning til effektivt at skabe udgangspunkter for downstream-udvikling af værktøjsforbindelser eller lægemiddelkandidater.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de mange brugergrupper, der har udført CFS-kampagner på HZB. Deres feedback førte til en gradvis forbedring af vores arbejdsgang. Vi vil gerne takke lægemiddeldesigngruppen på University of Marburg og FragMAX-gruppen på MAX IV, da det tætte samarbejde var grundlaget for flere udviklingsmæssige spring for forbedret CFS. Vi er taknemmelige for støtten fra det tyske forbundsministerium for undervisning og videnskab (BMBF), via projekterne Frag2Xtal og Frag4Lead (numrene 05K13M1 og 05K16M1). Vi er desuden taknemmelige for støtte via iNEXT-Discovery, projektnummer 871037, finansieret af Europa-Kommissionens Horizon 2020-program.
1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
Microscopes | Leica | n.a. | |
MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |