Krystallografisk fragmentscreening ved Helmholtz-Zentrum Berlin utføres ved hjelp av en arbeidsflyt med dedikerte sammensatte biblioteker, krystallhåndteringsverktøy, raske datainnsamlingsanlegg og i stor grad automatisert dataanalyse. Den presenterte protokollen har til hensikt å maksimere produksjonen av slike eksperimenter for å gi lovende utgangspunkt for nedstrøms strukturbasert liganddesign.
Fragmentscreening er en teknikk som bidrar til å identifisere lovende utgangspunkt for liganddesign. Gitt at krystaller av målproteinet er tilgjengelige og viser reprodusert røntgendiffraksjonsegenskaper med høy oppløsning, er krystallografi blant de mest foretrukne metodene for fragmentscreening på grunn av følsomheten. I tillegg er det den eneste metoden som gir detaljert 3D-informasjon om fragmentets bindingsmodus, noe som er viktig for etterfølgende rasjonell sammensatt evolusjon. Rutinemessig bruk av metoden avhenger av tilgjengeligheten av egnede fragmentbiblioteker, dedikerte midler til å håndtere et stort antall prøver, toppmoderne synkrotronbjelker for raske diffraksjonsmålinger og i stor grad automatiserte løsninger for analyse av resultatene.
Her presenteres den komplette praktiske arbeidsflyten og de inkluderte verktøyene for hvordan man utfører krystallografisk fragmentscreening (CFS) ved Helmholtz-Zentrum Berlin (HZB). Før denne arbeidsflyten er krystall-soaking forhold samt datainnsamlingsstrategier optimalisert for reproduserbare krystallografiske eksperimenter. Deretter, vanligvis i en en til to-dagers prosedyre, brukes et 96-medlem CFS-fokusert bibliotek som leveres som tørkede ferdige plater for å suge 192 krystaller, som deretter blinker avkjøles individuelt. De siste diffraksjonsforsøkene kan utføres innen en dag på de robotmonteringsstøttede strålelinjene BL14.1 og BL14.2 ved BESSY II elektronlagringsring som drives av HZB i Berlin-Adlershof (Tyskland). Behandling av krystallografiske data, raffinering av proteinstrukturene og treffidentifikasjon er rask og i stor grad automatisert ved hjelp av spesialiserte programvarerørledninger på dedikerte servere, noe som krever lite brukerinndata.
Bruk av CFS-arbeidsflyten på HZB muliggjør rutinemessige screeningeksperimenter. Det øker sjansene for vellykket identifisering av fragmenttreff som utgangspunkt for å utvikle mer potente bindemidler, nyttig for farmakologiske eller biokjemiske applikasjoner.
Det første skrittet i narkotikautviklingen er screening av forbindelser mot et mål av interesse. Tradisjonelt brukes store sammensatte biblioteker i rekkefølgen 100.000-1.000.000 oppføringer i biokjemiske analyser med høy gjennomstrømning i farmasøytisk industri. Denne strategien ble supplert med fragmentbasert legemiddeldesign (FBDD), en nyere metode som tok en kraftig økning de siste 20 årene og ble en mainstream-strategi for å generere ledende kandidater av høy kvalitet på grunn av flere iboende fordeler ved metoden1. Begrepet “fragment” refererer til et lite organisk molekyl som vanligvis inneholder mindre enn 20 ikke-hydrogen eller tunge atomer (HAer). Dermed er et fragment betydelig mindre enn de stoff- eller blylignende molekylene (vanligvis mindre enn 30 HAer) utforsket i konvensjonell høygjennomstrømningsscreening. Fragmenter er svakaffinitetspermer. Men sammenlignet med større molekyler er fragmenter mer allsidige, siden selv en liten samling av dem bedre kan representere det respektive kjemiske rommet av molekyler av samme størrelse2. Også utviklende fragmentscreening treff i blymolekyler er betydelig mer effektiv enn å optimalisere allerede størremolekyler 2,3,4,5. Det betyr at i påvente av tilstrekkelig følsomhet for deteksjonen, kan screening av fragmenter brukes effektivt og gir startpunkter av høy kvalitet for videre sammensatt evolusjon. Flere biofysiske metoder kan brukes til fragmentscreening, den mest populære er kjernemagnetisk resonans, røntgenkrystallografi, overflateplasmonresonans og termiske skiftanalyser. Disse metodene brukes enten parallelt eller på en sekvensiell måte, med sikte på å øke tilliten til treffene og redusere antall falske positiver eller falske negativer. En nylig gjennomført komparativ studie6 antydet imidlertid at sekvensiell screening kaskader skal unngås på grunn av den lave overlappingen mellom de forskjellige metodene.
Røntgenkrystallografi er en veletablert metode for strukturbestemmelse i atomdetaljer, men har nylig også blitt utviklet som et verktøy for screeningformål7,8. Ettersom proteinkrystaller tåler høye fragmentkonsentrasjoner (f.eks. 100 mM), kan krystallografisk fragmentscreening (CFS) konkurrere med andre biofysiske metoder for screening av fragmenter eller til og med overgå dem som en første-trinns screeningmetode6,9. En viktig forutsetning for CFS er imidlertid et validert krystalliseringssystem av målproteinet som reproduserer krystaller med diffraksjonsegenskaper til betydelig høy oppløsning, vanligvis bedre enn 2 Å.
En eksklusiv fordel med CFS sammenlignet med alle andre fragmentscreeningsmetoder er levering av detaljert 3D-informasjon om bindingsmodusen til de identifiserte fragmentene. Denne strukturelle informasjonen er helt avgjørende for den rasjonelle optimaliseringen av fragmenttreffene til bindemidler med høyere affinitet. Etablerte utarbeidelsesstrategier vokser, slår sammen og kobler fragmenttreff5. Dermed er relativt høy ligandeffektivitet gitt fra starten, og innføring av unødvendige eller romlige ikke egnede grupper kan unngås, og dermed redusere kjemiske syntesekostnader. Alt i alt har CFS uovertruffen fordeler som en startstrategi for legemiddeldesign.
Gitt at et bestemt biologisk mål oppfyller de høye kravene til CFS angående krystallkvalitet, er det noen hovedfaktorer som maksimerer sjansene for et vellykket resultat av slike screeningkampanjer. Det avhenger av kvaliteten på fragmentbiblioteket som brukes, på en effektiv arbeidsflyt for å utføre forsøkene før diffraksjonseksperimentet, på synkrotronstrålelinjer med tilstrekkelig automatisering og datainnsamlingshastighet, samt på måter og midler for i stor grad automatisert databehandling og analyse. Her presenteres hele arbeidsflyten fra krystall-soaking-eksperimentene til treffidentifikasjonen, i måten den er vellykket etablert på de makromolekylære krystallografistrålene ved BESSY II (Figur 1). Anlegget er åpent for faglige og industrielle brukere for samarbeid. I tillegg kan akademiske brukere av EU-land utenfor Tyskland enkelt søke om finansiering via iNEXT Discovery-prosjektet.
Det er uunnværlige forutsetninger for å kunne starte en CFS-kampanje og gjennomføre protokollen som er skissert i dette arbeidet: veldiffracting krystaller av målproteinet er tilgjengelige som kan reproduseres i store mengder, som er stabile ved omgivelsestemperatur, og som ble dyrket ved hjelp av en krystalliseringscocktail uten svært flyktige ingredienser. En annen forutsetning er egnetheten til krystallgitteret for eksperimentet. I et passende gitter må de interessante stedene til målproteinet eksponeres mot løsningsmiddelkanalene og dermed tilgjengelig. Et annet foregående trinn som er valgfritt, men likevel sterkt anbefalt for å sikre suksess i arbeidsflyten til CFS-kampanjen, er optimaliseringen av sugebetingelsen for eksperimentet. Vital benchmark-statistikk her er diffraksjonskraften til krystallen og de relevante datakvalitetsindikatorene, som bestemmes under dataskaleringsprosedyren. Typiske faktorer for å optimalisere er DMSO-toleranse, bufferkonsentrasjon og kryobeskyttelse. Selv om det ikke er en streng forutsetning som nærmere beskrevet nedenfor, kan DMSO som et ko-løsningsmiddel bidra til å øke fragmentløseligheten. Typiske tester bør omfatte bløtlegging av 0, 3, 6 eller 10 % (v/v) DMSO over natten. En økning av bufferkonsentrasjonen til 200 eller 300 mM bidrar til å forhindre tap av diffraksjonskvalitet på grunn av sporadiske pH-skiftende effekter som oppstår fra de høye fragmentkonsentrasjonene som skal brukes. Til slutt er det avgjørende å finne ut om og hvilket ekstra kryoprektant som kreves, og om det allerede kan inkluderes i soaking-tilstanden. I mange tilfeller er det imidlertid ikke nødvendig med et ekstra kryobeskyttende middel, fordi DMSO selv kan fungere som en kryo-beskytter. I så fall vil dette spare ett håndteringstrinn i det endelige eksperimentet. De fleste krystaller trenger mindre kryo-beskyttelse hvis blitskjølt på passende størrelse løkker, minimere eller unngå omkringliggende moderluten så mye som mulig. Men i sjeldne tilfeller er et lag av moderluten faktisk nødvendig for å forhindre skade på krystallen ved blitskjøling.
Antall treff oppnådd i en CFS-kampanje er ikke bare avhengig av legemiddelbarheten til målproteinet og egnetheten til krystallgitteret (se ovenfor), men det er også avhengig av kvaliteten på biblioteket. Bibliotekkvaliteten består av to aspekter: valg av forbindelser til biblioteket og konfekt av forbindelsene, (dvs. i hvilken fysisk form de presenteres for eksperimentet). For sammensatt utvalg kan ulike strategier brukes. De fleste bibliotekdesign inkluderer maksimering av det kjemiske mangfoldet av fragmentene. Et strategisk fokus kan være å inkludere fragmentenes kjemiske evne til oppfølgingsdesign, som for eksempel er brukt i Diamond-SGC-iNEXT-biblioteket10. Nok et strategisk fokus for bibliotekdesign kan være å maksimere representasjonen av kommersielt tilgjengelig kjemisk rom for fragmenter ved form- og farmakoforbasert klynge, som det har blitt eksemplifisert av F2X-bibliotekene utviklet ved HZB11. Mer spesifikt er F2X-Universal Library med 1103 medlemmer og representativt 96-sammensatt delsett for innledende CFS-kampanjer, som kalles F2X-Entry Screen, utviklet og F2X-Entry Screen er validert med hell11. F2X-Entry Screen er det primære valget for CFS-kampanjer på HZB. Deretter kan større kampanjer deretter utføres ved hjelp av F2X-Universal Library eller det 1056-medlemmers EU-OPENSCREEN fragmentbiblioteket12 som også tilbys på HZB. For tiden er disse bibliotekene tilgjengelige for brukere av de makromolekylære krystallografistrålene til BESSY II-synkrotronen i Berlin gratis på grunnlag av en samarbeidskontrakt. Dette gjelder også brukere via iNEXT Discovery-forslag. Videre er F2X-Entry Screen tilgjengelig for alle interesserte forskere på grunnlag av en materiell overføringsavtale.
Når det gjelder den fysiske presentasjonen av et bibliotek, blir to tilnærminger ofte vedtatt: fragmentene brukes enten som DMSO-lagerløsninger, eller fragmentene tørkes og immobiliseres på ferdige plater. Ved HZB presenteres både F2X-Entry Screen og de ikke-flyktige forbindelsene til F2X-Universal Library som tørkede forbindelser i en 3-linse 96-brønns MRC lavprofils krystalliseringsplate. Presentasjonen av fragmentene immobilisert i krystalliseringsplater har to viktige fordeler: For det første tillater det transport av screeningplatene til brukerens hjemmelaboratorium. Derfor kan soaking- og krystallhåndteringstrinnene i arbeidsflyten som presenteres her (trinn 1-3) utføres hvor som helst. For det andre kan DMSO-fri løsning benyttes. DMSO-sensitive mål kan dermed screenes enkelt, i stor grad beholde forventede trefffrekvenser11. Imidlertid øker DMSO fragmentløselighet, derfor er det verdt å sjekke DMSO-toleransen til et krystallsystem du velger på forhånd som beskrevet ovenfor.
Protokollen som er skissert nedenfor, vil beskrive et typisk eksperiment med en 96-sammensatt skjerm som F2X-Entry Screen. For det må ca 250 krystaller tilberedes i tide for å brukes ferskt. Det er sterkt tilrådelig å forberede soaks for alle 96 forbindelser i duplikat. Det anbefales, men valgfritt, å forberede ytterligere mock-soaks som senere vil hjelpe med dataanalyse ved hjelp av pan-data tetthet analyse (PanDDA) tilnærming for hit identifikasjon13. Mock-soaks er definert som soaking eksperimenter på proteinkrystaller ved hjelp av samme soaking løsning som fragmentet suger for samme inkubasjonstid, men ingen fragmenter er til stede. Hvis bløtleggingsløsningen er lik krystalliseringstilstanden, kan krystallene høstes direkte fra krystalliseringsplaten.
Avhengig av egenskapene til den robotiserte prøveveksleren, kan det hende at forskjellige puckformater må brukes. For øyeblikket må prøver for den HZB-opererte strålelinjen BL14.1 tilberedes i Unipuck-format, prøver for den HZB-opererte strålelinjen BL14.2 må tilberedes i SPINE puckformat. I denne protokollen antas forberedelse i Unipuck-format.
For en vellykket CFS-kampanje er det viktig å følge de beskrevne forutsetningene (se Introduksjon). Et pålitelig krystalliseringssystem er nødvendig for den reproduserbare veksten av mange godt diffracting krystaller, og en godt raffinert struktur er nødvendig som input apo modell for automatisert raffinement. Det er også viktig å sjekke at målstedet på proteinet (aktivt sted eller grensesnittområde) er tilgjengelig for fragmenter i krystallgitteret. Det er avgjørende å optimalisere soakingforholdene på forhånd for å sikre at bløtleggingen ikke forverrer krystallkvaliteten betydelig. Forsømmelse av disse aspektene vil sannsynligvis føre til et suboptimalt eksperiment, som vil være til begrenset bruk og vil i verste fall kreve en gjentakelse av hele eksperimentet.
Protokollen beskrevet ovenfor skisserer prosedyrene som følges under en standard CFS-kampanje. Hvis alle forutsetninger er oppfylt, bør minst 90% av alle gjennomvåte krystaller vise diffraksjon til høy oppløsning i et diffraksjonseksperiment. Hvis dette ikke er tilfelle, kan sugetidene forkortes til noen timer eller til og med minutter. På grunn av den gode løseligheten til de fleste fragmentene, bør dette være nok til å oppnå anstendige beleggsverdier. En typisk CFS-kampanje vil også resultere i en trefffrekvens på omtrent 10% eller høyere. For F2X-Entry Screen-valideringskampanjene11 og pågående brukerkampanjer med samme bibliotek er det observert enda høyere trefffrekvenser (20% og over, data ikke vist).
En generell advarsel om krystallografisk fragmentscreening er tilstedeværelsen av krystallografiske kontaktsider. Disse kan enten okkludere a priori kjente aktive nettsteder (som skal kontrolleres før screening, se ovenfor), eller disse kontaktsidene gir også ofte lommer og hot spots der fragmenter kan binde seg. Slike fragmenttreff vil være gjenstander av krystalliseringsgitteret og vil sannsynligvis ikke binde seg til proteinet i løsningen. Disse hendelsene har en tendens til å forekomme oftere i soaking eksperimenter enn i co-krystallisering eksperimenter (sannsynligvis på grunn av høyere fragmentkonsentrasjoner ansatt i soaking eksperimenter). Men ifølge tidligere erfaring utgjør de generelt bare en mindre del av treffene som er oppnådd. I valideringskampanjen F2X-Entry Screen ved hjelp av endothiapepsin (EP) og det spleiseosomale proteinproteinkomplekset Prp8RNaseH og Aar2 (AR) skjedde for eksempel de fleste treffene på lovende steder11. For EP var 27 av de 37 observerte bindingshendelsene plassert på det aktive stedet (dvs. peptidklemmen til denne protease). De 10 fjernbindingshendelsene består av to løsningsmiddelutsatte bindingshendelser og åtte krystallkontaktbindingshendelser (tilsvarende fem unike treff). Ekskludert disse krystallkontakttreffene vil fortsatt gjenspeile en samlet hastighet på 24% unike treff for EP-kampanjen. Det er også viktig å legge merke til at bindingshendelser som er fjernt på et kjent aktivt sted (unntatt krystallkontaktpermer) også kan være interessante (f.eks. avsløre nye hot spots eller allosteriske steder av proteinet). For AR-kampanjen (i samme publikasjon), av de 23 observerte bindingshendelsene, var syv plassert ved krystallkontakter, en var plassert ved direkte grensesnitt av de to proteinene, syv var plassert på kjente proteinproteininteraksjonssteder med andre bindende partnere i den større biologiske konteksten (derav forskjellige monteringsstadier av skjøteosomet), åtte bindende hendelser avslørte to hot spots på AR av ennå ukjent funksjon og en er på en løsningsmiddeloverflate av Prp8Rnas . Derfor, unntatt hendelsene ved krystallkontakter og Prp8RnaseH singleton, er antall potensielt nyttige bindingshendelser 15 (tilsvarende 14 unike treff) og dermed en trefffrekvens på 15,6%. Disse treffene kan være utgangspunkt for design av proteinproteininteraksjonsmodulatorer eller for verktøyforbindelser som tar sikte på å utforske de to oppdagede Aar2-hot spots. Samlet, også i tråd med gjennomførte brukerkampanjer, må ofte bare en mindre del av treffene i krystallografisk fragmentscreening ses bort fra som artefakter. Dette vil imidlertid også i stor grad være målavhengig.
Hvis trefffrekvensen er betydelig lavere, kan dette indikere et av følgende problemer relatert til målproteinet. For eksempel, i en CFS-kampanje mot en viral cysteinprotease ble det observert en trefffrekvens på bare 3% (data ikke vist). Det viste seg at proteinet som ble brukt sannsynligvis ble kjemisk modifisert på sitt aktive sted. I et slikt tilfelle kan et annet proteinpreparat løse problemet. Hvis krystaller er svært DMSO-intolerante, kan F2X-Entry Screen også brukes uten DMSO, selv om resultatene kan variere til en viss grad. De fleste treffene oppnådd i nærvær av DMSO vil også dukke opp i sitt fravær. Det vil også være noen treff som ikke kan observeres i fravær av DMSO, selv om de kan observeres i nærvær. Og til slutt vil det være noen som bare dukker opp i fravær av DMSO.
De alvorligste vanskelighetene oppstår hvis proteinet gjennomgår en indusert passformbevegelse på stoffbinding. Mest sannsynlig vil krystallgitteret ikke tolerere proteinbevegelsen, og krystallene vil gå i oppløsning. I et slikt tilfelle er det eneste valget å ty til co-krystallisering av proteinet og fragmentene. Dette kan imidlertid føre til nye krystallformer. Derfor vil mye av automatiseringen av hele prosessen ikke fungere effektivt lenger. Heldigvis, i de fleste CFS-kampanjer utført på HZB så langt, har denne typen problemer ikke blitt oppstått. Det kan være at den svake bindingen av et fragment ikke gir nok energi til å indusere en proteinbevegelse, spesielt hvis den krystalliserte konformasjonen stabiliseres av krystallpakkekrefter.
En annen alvorlig begrensning av metoden som forfatterne har møtt så langt er når krystalliseringscocktailen (og dermed sugeløsningen) inneholder flyktige forbindelser. Da blir det nesten umulig å utføre all krystallhåndtering på en meningsfull måte.
Ulike proteiner kan inneholde medikamenterbare steder i større eller mindre grad. For eksempel formidles proteinproteininteraksjoner vanligvis av utvidede flate overflater som er vanskeligere å målrette mot. Fragmentbindingshastigheten vil derfor sannsynligvis avhenge av strukturen til proteinets molekylære overflate. I et ekstremt tilfelle kan det hende at et protein ikke inneholder egnede overflate hot spots som fungerer som målsteder for fragmentbinding. Til tross for et omhyggelig utført eksperiment, vil det derfor ikke komme fragmenttreff fra visningen. Forfatterne har imidlertid så langt ikke opplevd en slik situasjon.
I prinsippet, ved hjelp av protokollen som er skissert ovenfor, kan krystall soaking og høsting en del av en CFS-kampanje utføres i ethvert laboratorium som er utstyrt for krystallhåndtering. Dette skiller metodikken ved HZB fra andre CFS-anlegg og kan i noen tilfeller være en fordel. For eksempel, hvis krystallene ikke lett kan produseres på nytt på et annet sted, eller hvis reisen til eksperimentene er begrenset (f.eks. i en verdensomspennende pandemisituasjon), er brukere på HZB derfor utstyrt med hele utstyret (pucks, verktøy, EasyAccess Frame, prøveholdere, etc.) som et bærbart sett.
Kravene til et stort antall prøveholdere og kryogen lagringskapasitet er imidlertid fortsatt mer praktisk oppfylt på dedikerte CFS-anlegg. Videre er behovet for innsamling av mange diffraksjonsdatasett sterkt talsmenn for lokalisering av disse anleggene nær bjelkelinjer som er rettet mot en høy prøvegjennomstrømning. Eksempler på dette er bjelkelinjene I04-1 ved Diamond Light Source og det tilknyttede XChem-anlegget i UK8,25, MASSIF-strålelinjene ved ESRF i Frankrike26 eller FragMAX-anlegget ved BioMAX-strålelinjen ved MAX IV i Sverige18.
I fremtiden kan man se for seg å designe CFS-eksperimenter uten behov for krystallhåndtering helt. Første fremskritt i denne retningen er rapportert. For eksempel, ved akustisk væskeoverføring som tillater blanding av både de krystallholdige løsningene og fragmentløsningene direkte på maske-type prøveholdere27. En annen tilnærming ble brukt til XFEL-basert ligandscreening. I et prinsippbeviseksperiment ble det utarbeidet en krystallslam i batch, og bløtlegging og diffraksjonsdatainnsamling ble utført på en silisiumfast målbrikke28. Imidlertid er disse tilnærmingene fortsatt under utvikling og langt fra å være gjeldende for et bredt spekter av proteinmål eller mulig for CFS-anlegg som rutine.
Med protokollen i dette arbeidet har detaljerte instruksjoner for vellykket utførelse av CFS-kampanjer rett frem på HZB (og andre steder) blitt skissert og generell veiledning og nyttige praktiske tips for å forberede og gjennomføre slike eksperimenter med høyere sjanser for suksess er gitt. Til syvende og sist bidrar bedre odds og suksessrater i CFS-screening i stor grad til å effektivt gi utgangspunkt for nedstrømsutvikling av verktøyforbindelser eller narkotikakandidater.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker de mange brukergruppene som har utført CFS-kampanjer på HZB. Deres tilbakemeldinger førte til den trinnvise forbedringen av arbeidsflyten vår. Vi vil takke legemiddeldesigngruppen ved University of Marburg og FragMAX-gruppen ved MAX IV, da de nære samarbeidene var grunnlaget for flere utviklingssprang for forbedret CFS. Vi er takknemlige for støtten fra det tyske føderale utdannings- og vitenskapsdepartementet (BMBF), via prosjektene Frag2Xtal og Frag4Lead (tallene 05K13M1 og 05K16M1). Vi er også takknemlige for støtten via iNEXT-Discovery, prosjektnummer 871037, finansiert av Horisont 2020-programmet til EU-kommisjonen.
1 µL pipet | Eppendorf | EP3123000012 | |
12 channel pipet, 100 µL | Eppendorf | EP4861000791 | |
Blow dryer | TH-Geyer | 9.106 788 | |
Crystal containing crystallization plates | Contains crystals to be soaked | ||
Crystallization incubator | Providing constant temperature for crystallization experiment, at HZB: 20°C | ||
Dual Thickness MicroLoops (LD) of different aperture sizes | MiTeGen | various, e.g. M5-L18SP-75LD |
250 loops in the appropiate size needed for the protocol, can be provided by HZB |
EasyAccess Frame | HZB | The EasyAccess Frame is a special device for handling multiple crystals, which was developed at the HZB (Barthel et al., 2021). | |
F2X-Entry Screen plate | HZB | Developed F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020) | |
Glas spot plate | VWR | MARI1406506 | |
Liquid nitrogen | At least a filled up 5 L can | ||
Liquid nitrogen storage can | n.a. | n.a. | |
Magentic crystal wand | MiTeGen | M-R-1013198 | |
Microscopes | Leica | n.a. | |
MRC 3-lens 96-well low profile crystallization plate | SwissCI | 3W96TLP-UVP | For mock-soaked crystals (optional) |
Reagent reservoir | Carl Roth | EKT6.1 | 25 ml volume |
Sample tracking template | https://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking. xlsx |
||
Scalpel | B. Braun | BA825SU | |
Sealing foil for microtiter plates | GreinerBioOne | 676070 | |
Shelved puck shipping canes (for Unipucks) | MiTeGen | M-CP-111-065 | 2 canes made of aluminum; can be provided by the HZB |
Soaking solution | At least 5 ml are needed | ||
Soaking solution including cryo-protectant, 150µL | Only needed if soaking solution is not cryo-protectant already | ||
Tissues | Roth (Kimberly Clark Professional) | AA64.1 | |
Transport dewar (Whartington dry shipper) | MiTeGen | TW-CX100 | 2 Travel dewars for storage of the 2 unipuck canes, alternatively a storage dewar of type VHC35 or similar could be used. |
Unipuck foam dewars with lid | MiTeGen | M-CP-111-022 | two foam dewars especially suited for unipuck handling described in the protocol if SPINE pucks are used, different foam dewars might have to be applied. |
Unipuck starter set | MiTeGen | M-CP-UPSK001 | Can be provided by the HZB |
Unipucks | MiTeGen | M-CP-111-021 | 14 unipucks; can be provided by the HZB |