Vi beskriver ett snabbt och robust protokoll för att berika invarianta naturliga killer T (iNKT) celler från mus mjälte och expandera dem in vitro till lämpliga nummer för in vitro och in vivo studier.
Invariant Natural Killer T (iNKT) celler är medfödda-liknande T Lymfocyter uttrycker en bevarad semi-invariant T cell receptor (TCR) specifik för själv eller mikrobiella lipid antigener presenteras av den icke-polymorfa MHC klass I-relaterade molekylen CD1d. Prekliniska och kliniska studier stöder en roll för iNKT celler i cancer, autoimmunitet och infektionssjukdomar. iNKT-celler är mycket bevarade i hela arten och deras undersökning har underlättats av musmodeller, inklusive CD1d-bristfälliga eller iNKT-bristfälliga möss, och möjligheten att otvetydigt upptäcka dem hos möss och män med CD1d-tetramerer eller mAbs som är specifika för semiinvariant TCR. INKT-celler är dock sällsynta och de måste utökas för att nå hanterbara siffror för alla studier. Eftersom genereringen av primära mus iNKT cellinje in vitro har visat sig svårt, har vi inrättat ett robust protokoll för att rena och expandera mjälte iNKT celler från iVα14-Jα18 transgena möss (iVα14Tg), där iNKT celler är 30 gånger vanligare. Vi visar här att primära splenic iVα14Tg iNKT celler kan berikas genom en immunomagnetisk separation process, vilket ger ca 95-98% ren iNKT celler. De renade iNKT-cellerna stimuleras av anti-CD3/CD28 pärlor plus IL-2 och IL-7, vilket resulterar i 30-faldig expansion på dag +14 av kulturen med 85-99% renhet. De expanderade iNKT-cellerna kan lätt manipuleras genetiskt, vilket ger ett ovärderligt verktyg för att dissekera mekanismer för aktivering och funktion in vitro och, ännu viktigare, även vid adoptivöverföring in vivo.
Invarianta naturliga mördar T-celler (iNKT-celler) är medfödda T-lymfocyter som uttrycker en semi-invariant αβ T-cellsreceptor (TCR), bildad hos möss av en invariant Vα14-Jα18-kedja parad med en begränsad uppsättning olika Vβ-kedjor1, vilket är specifikt för lipidantigener som presenteras av MHC-klass I-relaterad molekyl CD1d2. iNKT-celler genomgår ett agonistiskt urvalsprogram som resulterar i förvärv av en aktiverad /medfödd effektorfenotyp redan i tymus, som sker genom flera mognadsstadier3,4, som producerar en CD4+ och en CD4– delmängd. Genom detta program förvärvar iNKT-celler distinkta T helper (TH)effector fenotyper, nämligen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) och TH17 (iNKT17), identifierbar genom uttryck av transkriptionsfaktorerna T-bet, GATA3, PLZF respektive RORγt,respektive 5. iNKT-celler känner igen en rad mikrobiella lipider men är också självreaktiva mot endogena lipider som är uppreglerade i samband med patologiska situationer av cellstress och vävnadsskador, såsom cancer och autoimmunitet2. Vid aktivering modulerar iNKT-celler funktionerna hos andra medfödda och adaptiva immuneffektorceller via direktkontakt och cytokinproduktion2.
Undersökningarna av iNKT-celler har underlättats av musmodeller, inklusive CD1d-bristfälliga eller Jα18-bristfälliga möss, och genom produktion av antigenbelastade CD1d-tetramerer plus generering av monoklonala antikroppar (mAbs) som är specifika för den mänskliga semiinvarianta TCR. Genereringen av primära musen iNKT cellinje har dock visat sig svårt. För att bättre karakterisera antitumörfunktionerna hos iNKT-celler och för att använda dem för adoptivcellsterapi, inrättar vi ett protokoll för att rena och expandera splenic iNKT-celler av iVα14-Jα18 transgena möss (iVα14Tg)6, där iNKT-celler är 30 gånger vanligare än hos vilda möss.
Expanderade iNKT-celler kan utnyttjas för in vitro-analyser och in vivo vid överföring tillbaka till möss. I den här inställningen har vi till exempel visat deras potenta antitumöreffekter7. Dessutom är in vitro-utökade iNKT-celler mottagliga för funktionell modifiering via genöverföring eller redigering före injektionen in vivo8, vilket möjliggör insiktsfull funktionell analys av molekylära vägar, samt banar väg för avancerade cellterapier.
Här visar vi ett reproducerbart och genomförbart protokoll för att få miljontals färdiga iNKT-celler. På grund av bristen på dessa celler in vivo, var en metod för att expandera dem välbehövlig. Det protokoll vi föreslår kräver varken en viss instrumentering eller ett stort antal möss. Vi utnyttjade iVα14-Jα18 transgena möss med avsikt att minska antalet möss som behövs för proceduren.
Ett annat framgångsrikt protokoll för iNKT-cellexpansion från iVα14-Jα18 transgena m…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Paolo Dellabona och Giulia Casorati för vetenskapligt stöd och kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar också NIH Tetramer Core Facility för mus CD1d tetramer. Studien finansierades av Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (till M.F.) och Italian Association for Cancer Research (AIRC) fellowship 2019-22604 (till G.D.).
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
hrIL-2 | Chiron Corp | ||
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
PFA | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |