Vi beskriver en rask og robust protokoll for å berike invariante naturlige killer T (iNKT) celler fra mus milt og utvide dem in vitro til passende tall for in vitro og in vivo studier.
Invariant Natural Killer T (iNKT) celler er medfødt-lignende T Lymphocytes uttrykker en konservert semi-invariant T celle reseptor (TCR) spesifikk for selv eller mikrobielle lipid antigener presentert av ikke-polymorfisk MHC klasse I-relatert molekyl CD1d. Prekliniske og kliniske studier støtter en rolle for iNKT celler i kreft, autoimmunitet og smittsomme sykdommer. iNKT-celler er svært bevart gjennom arter, og deres undersøkelse har blitt tilrettelagt av musemodeller, inkludert CD1d-mangelfulle eller iNKT-mangelfulle mus, og muligheten til å utvetydig oppdage dem hos mus og menn med CD1d tetramers eller mAbs som er spesifikke for den semi-konstante TCR. Imidlertid er iNKT-celler sjeldne, og de må utvides for å nå håndterbare tall for enhver studie. Fordi genereringen av primærmus iNKT cellelinje in vitro har vist seg vanskelig, har vi satt opp en robust protokoll for å rense og utvide miltniske iNKT-celler fra iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg), der iNKT-celler er 30 ganger hyppigere. Vi viser her at primære milt iVα14Tg iNKT-celler kan berikes gjennom en immunomagnetisk separasjonsprosess, noe som gir ca 95-98% rene iNKT-celler. De rensede iNKT-cellene stimuleres av anti-CD3 / CD28 perler pluss IL-2 og IL-7, noe som resulterer i 30 ganger utvidelse om dagen +14 av kulturen med 85-99% renhet. De utvidede iNKT-cellene kan enkelt genetisk manipuleres, og gir et uvurderlig verktøy for å dissekere mekanismer for aktivering og funksjon in vitro og, enda viktigere, også ved adoptivoverføring in vivo.
Invariant Natural killer T celler (iNKT celler) er medfødt-lignende T-lymfocytter som uttrykker en semi-invariant αβ T celle reseptor (TCR), dannet i mus av en invariant Vα14-Jα18 kjede sammen med et begrenset sett med forskjellige Vβ kjeder1, som er spesifikk for lipid antigener presentert av MHC klasse I-relatert molekyl CD1d2. iNKT-celler gjennomgår et agonistisk utvalgsprogram som resulterer i oppkjøpet av en aktivert / medfødt effektorfenotype allerede i tymus, som oppstår gjennom flere modningsstadier3,4, og produserer en CD4+ og en CD4– delsett. Gjennom dette programmet får iNKT-celler distinkte T-hjelper (TH) effektorfenotyper, nemlig TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) og TH17 (iNKT17), identifiserbar ved uttrykk for transkripsjonsfaktorene T-bet, GATA3, PLZF og RORγt, henholdsvis5. iNKT-celler gjenkjenner en rekke mikrobielle lipider, men er også selvreaktive mot endogene lipider som er oppregulert i sammenheng med patologiske situasjoner med cellestress og vevsskade, for eksempel kreft og autoimmunitet2. Ved aktivering modulerer iNKT-celler funksjonene til andre medfødte og adaptive immuneffektorceller via direkte kontakt og cytokinproduksjon2.
Undersøkelsene av iNKT-celler har blitt tilrettelagt av musemodeller, inkludert CD1d-mangelfulle eller Jα18-mangelfulle mus, og ved produksjon av antigenbelastede CD1d tetramerer pluss generering av monoklonale antistoffer (mAbs) som er spesifikke for den menneskelige semi-invariantE TCR. Imidlertid har genereringen av primærmus iNKT cellelinje vist seg vanskelig. For bedre å karakterisere antitumorfunksjonene til iNKT-celler og for å bruke dem til adoptivcelleterapi, setter vi opp en protokoll for å rense og utvide miltika iNKT-celler av iVα14-Jα18 transgene mus (iVα14Tg)6, der iNKT-celler er 30 ganger hyppigere enn hos villtype mus.
Utvidede iNKT-celler kan utnyttes for in vitro-analyser, og in vivo ved overføring tilbake til mus. I denne innstillingen har vi for eksempel vist deres potente anti-tumor effekter7. Videre er in vitro utvidede iNKT-celler egnet til funksjonell modifikasjon via genoverføring eller redigering før injeksjonen in vivo8, noe som gir innsiktsfull funksjonell analyse av molekylære veier, samt baner vei for avanserte celleterapier.
Her viser vi en reproduserbar og gjennomførbar protokoll for å skaffe millioner av iNKT-celler som er klare til bruk. På grunn av paucity av disse cellene in vivo, var det svært nødvendig med en metode for å utvide dem. Protokollen vi foreslår krever verken en bestemt instrumentering eller et høyt antall mus. Vi utnyttet iVα14-Jα18 transgene mus med vilje for å redusere antall mus som trengs for prosedyren.
En annen vellykket protokoll for iNKT celleutvidelse fra iVα14-Jα18 transg…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Paolo Dellabona og Giulia Casorati for vitenskapelig støtte og kritisk lesning av manuskriptet. Vi takker også NIH Tetramer Core Facility for mus CD1d tetramer. Studien ble finansiert av Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (til M.F.) og Italian Association for Cancer Research (AIRC) fellowship 2019-22604 (til G.D.).
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) solution | in house | 0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4 | |
anti-FITC Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-701 | |
anti-PE Microbeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
CD19 -FITC | Biolegend | 115506 | clone 6D5 |
CD1d-tetramer -PE | NIH tetramer core facility | mouse PBS57-Cd1d-tetramers | |
CD4 -PeCy7 | Biolegend | 100528 | clone RM4-5 |
Fc blocker | BD Bioscience | 553142 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0186L | heat-inactivated and filtered .22 before use |
FOXP3 Transcription factor staining buffer | eBioscience | 00-5523-00 | |
H2 (IAb) -FITC | Biolegend | 114406 | clone AF6-120.1 |
hrIL-2 | Chiron Corp | ||
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MACS buffer (MB) | in house | 0.5% Bovine Serum Albumin (BSA; Sigma-Aldrich) and 2Mm EDTA | |
MS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin and streptomycin (Pen-Strep) | Lonza | 15140-122 | |
PermWash | BD Bioscience | 51-2091KZ | |
PFA | Sigma | P6148 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | EuroClone | ECB4004L | |
PMA | Sigma | P1585 | |
Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
Recombinat Mouse IL-7 | R&D System | 407-ML-025 | |
RPMI 1640 with glutamax | Gibco | 61870-010 | |
sodium pyruvate | Gibco | 11360-039 | |
TCRβ -APC | Biolegend | 109212 | clone H57-597 |
αCD3CD28 mouse T activator Dynabeads | Gibco | 11452D | |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |