صياغة وتميز الجسيمات النانوية الدهنية لتسليم الجينات باستخدام منصة خلط Microfluidic
Summary
يتم تطوير الجسيمات النانوية الدهنية باستخدام نهج منصة خلط microfluidic لتغليف الحمض النووي الريبي والحمض النووي.
Abstract
وقد استخدمت ناقلات الأدوية القائمة على الدهون لأنظمة التسليم المتاحة سريريا وتجاريا بسبب صغر حجمها، وعدم التوافق البيولوجي، وكفاءة التغليف العالية. استخدام الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) لتغليف الأحماض النووية مفيد لحماية الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من التدهور ، مع تعزيز امتصاص الخلوية أيضا. غالبا ما تحتوي LNPs على مكونات دهون متعددة بما في ذلك الدهون المؤينة والدهون المساعد والكوليسترول والبولي إيثيلين غليكول (PEG) الدهون المترافقة. يمكن ل LNPs تغليف الأحماض النووية بسهولة بسبب وجود الدهون المؤينة ، والتي في درجة الحموضة المنخفضة هي cationic وتسمح بالتعقيد مع الحمض النووي الريبي المشحون سلبيا أو الحمض النووي. هنا تتشكل LNPs عن طريق تغليف رسول الحمض النووي الريبي (مرنا) أو الحمض النووي البلازميد (pDNA) باستخدام الخلط السريع للمكونات الدهنية في مرحلة عضوية وعنصر حمض النيوكليك في مرحلة مائي. يتم إجراء هذا الخلط باستخدام منصة خلط دقيقة microfluidic، مما يسمح للتجميع الذاتي الجسيمات النانوية مع الحفاظ على تدفق صفح. يتم قياس حجم الهيدروديناميك والتعددية باستخدام تشتت الضوء الديناميكي (DLS). يتم تحديد الشحنة السطحية الفعالة على LNP من خلال قياس إمكانات زيتا. تتميز كفاءة التغليف باستخدام صبغة فلورية لقياس الحمض النووي المحاصر. وتبين النتائج التمثيلية إمكانية استنساخ هذه الطريقة والتأثير الذي يترتب على مختلف معايير الصياغة والعملية على الأساليب غير الرسمية المتقدمة.
Introduction
وتستخدم شركات نقل الأدوية لحماية وتقديم العلاجية مع خصائص مواتية نموذجية بما في ذلك السمية الخلوية منخفضة, زيادة التوافر البيولوجي, وتحسين الاستقرار1,2,3. وقد تم استكشاف الجسيمات النانوية البوليمرية، micelles، والجسيمات القائمة على الدهون سابقا لتغليف الحمض النووي والتسليم4،5،6،7. وقد استخدمت الدهون في أنواع مختلفة من أنظمة النانوكارير، بما في ذلك الليبوسومات، والجسيمات النانوية الدهنية، لأنها متوافقة بيولوجيا مع استقرار عالية8. LNPs يمكن تغليف بسهولة الأحماض النووية لتسليم الجينات9،10. أنها تحمي حمض النوى من التدهور عن طريق بروتياز المصل خلال الدورة الدموية الجهازية11 ويمكن تحسين التسليم إلى مواقع محددة، كما التضاريس السطحية والخصائص الفيزيائية للNPs تؤثر على التوزيع الحيوي12. LNPs أيضا تحسين اختراق الأنسجة وامتصاصالخلوية 9. وقد أظهرت الدراسات السابقة نجاح تغليف سيرنا داخل LNP13، بما في ذلك أول علاج LNP متاح تجاريا يحتوي على علاج siRNA لعلاج اعتلال الأعصاب من الداء النشواني الوراثي بوساطة transthyretin14 العلاج الذي وافقت عليه إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) ووكالة الأدوية الأوروبية في عام 2018. في الآونة الأخيرة ، ويجري دراسة LNPs لتسليم أكبر moieties حمض النوى ، وهي ميرنا والحمض النووي9. اعتبارا من عام 2018 ، كان هناك ~ 22 نظاما لتوصيل الحمض النووي القائم على الدهون تخضع لتجارب سريرية14. بالإضافة إلى ذلك، ميرنا التي تحتوي على LNPs هي حاليا المرشحين الرئيسيين، وقد استخدمت للقاح COVID-1915،16. النجاح المحتمل لهذه العلاجات الجينية غير الفيروسية يتطلب تشكيل جزيئات صغيرة (~ 100 نانومتر) ومستقرة وموحدة مع تغليف عالية من الحمض النووي.
وقد أظهرت استخدام الدهون المؤينة كعنصر رئيسي في صياغة الشرطة الوطنية الليبيرية مزايا للتعقيد والتغليف والتسليم effciciency14. الدهون المؤينة وعادة ما يكون ثابت فصيل حمض (pKa) < 7; على سبيل المثال، ديلينوليمثيل-4-ديميثيلامينوبوتيرات (د-لين-MC3-DMA)، والدهون المؤينة المستخدمة في صياغة LNP وافقت ادارة الاغذية والعقاقير، لديه pKa من 6.4417. في انخفاض الرقم الهيدروجيني ، تصبح مجموعات الأمين على الدهون المؤينة بروتونات ومحملة بشكل إيجابي ، مما يسمح للتجميع مع مجموعات فوسفات مشحونة سلبا على الحمض النووي الريبي والحمض النووي. وتستخدم نسبة أمين ، “ن” ، والمجموعات إلى الفوسفات ، “ف” ، مجموعات لتحسين التجميع. تعتمد نسبة N/P على الدهون والأحماض النووية المستخدمة ، والتي تختلف وفقا للصياغة18. بعد التشكيل ، يمكن تعديل درجة الحموضة إلى درجة الحموضة المحايدة أو الفسيولوجية للسماح بالإدارة العلاجية. في هذه القيم درجة الحموضة، يتم أيضا إزالة الدهون المؤينة التي تضفي شحنة سطح محايدة إلى الشرطة الوطنية الليبيرية.
الدهون المؤينة يساعد أيضا في الهروب endosomal19،20. LNPs الخضوع لداء الغدد الصماء أثناء امتصاص الخلوية ويجب أن يطلق سراحه من الاندوسوم من أجل تسليم البضائع مرنا في سيتوبلازم الخلية أو الحمض النووي البضائع إلى النواة21. داخل الانسوم هو عادة بيئة أكثر حمضية من الوسط خارج الخلية، مما يجعل الدهون المؤينة مشحونة إيجابيا22،23. يمكن أن تتفاعل الدهون المؤينة المشحونة إيجابيا مع الشحنات السلبية على غشاء الدهون الاندوسومالي ، والتي يمكن أن تسبب زعزعة استقرار الإنسوم مما يسمح بإطلاق LNP وحمض النيوكليك. ويجري حاليا دراسة مختلف الدهون المؤينة لتحسين فعالية كل من توزيع LNP، فضلا عن الهروب endosomal14.
وتشمل المكونات النموذجية الأخرى للشرطة الوطنية الليبيرية الدهون المساعد، مثل فوسفاتيديلكولين (PC) أو فوسفوثانامين (PE) الدهون. 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوثانولامين (DOPE)، 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوخ السولين (DSPC)، و 1،2-ديوليويل-سن-غليسيرو-3-فوسفوتشولين (DOPC) هي شائعة الاستخدام الدهون المساعد24،25. وقد ثبت DOPE لتشكيل المرحلة السداسية الثاني المقلوب (HII) وتعزيز العدوى عن طريق الانصهار الغشاء26, في حين كان يعتقد DSPC لتحقيق الاستقرار LNPs مع هندستها أسطواني27. كما يتم دمج الكوليسترول في صياغة من أجل زيادة صلابة الغشاء، مما يساعد في وقت لاحق في استقرار الشرطة الوطنية الليبيرية. وأخيرا، يتم تضمين الجليكولات البولي إيثيلين المترافقة مع الدهون (PEG) في صياغة لتوفير حاجز الستيريك اللازم للمساعدة في التجميع الذاتي للجسيمات27. كما يحسن PEG استقرار التخزين LNPs عن طريق منع التجميع. وعلاوة على ذلك، يستخدم PEG في كثير من الأحيان كعنصر الشبح ويمكن أن تزيد من وقت التداول لLNPs. ومع ذلك، يمكن أن تشكل هذه السمة أيضا تحديات لتجنيد LNPs إلى خلايا الكبد من خلال آلية استهداف الذاتية التي يقودها apolipoprotein E (ApoE)28. وهكذا، فقد حققت الدراسات في طول سلسلة أسيل لنشر PEG من الشرطة الوطنية الليبيرية، ووجدت أن أطوال قصيرة (C8-14) ينأى عن الشرطة الوطنية الليبيرية وأكثر قابلية لتوظيف ApoE بالمقارنة مع أطوال أطول أسيل28. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن درجة تشبع ذيل الدهون التي يتم اقتران PEG بها تؤثر على توزيع الأنسجة ل LNPs29. في الآونة الأخيرة ، تبين أن توين 20 ، وهو من المواد الخافرة للأمواج شائعة الاستخدام في تركيبات منتجات الأدوية البيولوجية ولها ذيل دهون طويل غير مشبع ، لديه إصابة عالية في استنزاف الغدد الليمفاوية مقارنة ب PEG-DSPE ، والتي قامت إلى حد كبير بإصابة العضلات في موقع الحقن29. يمكن تحسين هذه المعلمة لتحقيق التوزيع الحيوي LNP المطلوب.
وتشمل الطرق التقليدية لتشكيل LNPs طريقة الترطيب رقيقة الفيلم وطريقة حقن الإيثانول27. في حين أن هذه التقنيات متاحة بسهولة ، فهي أيضا كثيفة العمالة ، ويمكن أن تؤدي إلى كفاءة تغليف منخفضة ، وتشكل تحديا لتوسيع نطاق27. وقد أدى التقدم في تقنيات الخلط في أساليب أكثر قابلية لتوسيع نطاق، في حين وضع جزيئات أكثر اتساقا27. وتشمل هذه الأساليب تي تقاطع خلط، خلط الرنجة متداخلة، وmicrofluidic الهيدروديناميكية مع التركيز27. كل طريقة لها بنية فريدة من نوعها، ولكن كل تسمح لخلط سريع لمرحلة مائي يحتوي على حمض النيوكليك مع مرحلة عضوية تحتوي على مكونات الدهون، مما أدى إلى تغليف عالية من الحمض النووي27. في هذا البروتوكول، يتم استخدام خلط سريع وتسيطر عليها من خلال خرطوشة microfluidic، والذي يستخدم تصميم خلط الرنجة متداخلة. يحدد هذا البروتوكول إعداد الحمض النووي الذي يحتوي على LNPs وتجميعه وتوصيفه.
Protocol
Representative Results
Discussion
تعد إمكانية إعادة الإنتاج والسرعة وانخفاض الحجم مزايا كبيرة لاستخدام خلط السائل الدقيق لتشكيل LNPs مقارنة بالطرق الأخرى الموجودة (على سبيل المثال ، ترطيب فيلم الدهون وحقن الإيثانول). لقد أثبتنا قابلية استنساخ هذه الطريقة دون أي تأثير على كفاءة التغليف أو حجم الجسيمات الملاحظ مع دفعات LNP ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكرا لأتول سالوجا، ياتين غوكارن، ماريا تيريزا بيراتشيا، والتر شوينجر، وفيليب زاكاس على توجيهاتهم ومساهماتهم في تطوير الشرطة الوطنية الليبيرية.
Materials
| 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (C-14 PEG) | Avanti Polar Lipids | 880151P | |
| 10 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1121-3810 | |
| 1000 µl Graduated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1111-2831 | |
| 20 µl Beveled Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-1810 | |
| 200 µl Graudated Filter Tips (RNase-,DNase-, DNA-free) | USA Scientific | 1120-8810 | |
| 3β-Hydroxy-5-cholestene, 5-Cholesten-3β-ol (Cholesterol) | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (1 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes (3 ml syringe) | Thermo Fisher Scientific | 14-823-436 | |
| BD Vacutainer General Use Syringe Needles (BD Blunt Fill Needle 18G) | Thermo Fisher Scientific | 23-021-020 | |
| Benchtop Centrifuge | Beckman coulter | ||
| Black 96 well plates | Thermo Fisher Scientific | 14-245-177 | |
| BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA-free microcentrifuge tubes (1.5mL) | Thermo Fisher Scientific | 14-380-813 | |
| Citric Acid | Fisher Scientific | 02-002-611 | |
| Corning 500ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 um pore | Corning | 430769 | |
| Disposable folded capillary cells | Malvern | DTS1070 | |
| Ethyl Alcohol, Pure 200 proof | Sigma-Aldrich | 459844 | |
| Fisher Brand Semi-Micro Cuvette | Thermo Fisher Scientific | 14955127 | |
| Invitrogen Conical Tubes (15 mL) (DNase-RNase-free) | Thermo Fisher Scientific | AM12500 | |
| MilliporeSigma Amicon Ultra Centrifugal Filter Units | Thermo Fisher Scientific | UFC901024 | |
| NanoAssemblr Benchtop | Precision Nanyosystems | ||
| Nuclease-free water | Thermo Fisher Scientific | AM9930 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | AM9624 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | |
| Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | R11490 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | 02-004-036 | |
| Sodium Citrate, Dihydrate, granular | Fisher Scientific | 02-004-056 | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | ||
| Zetasizer Nano | Malvern |
References
- Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
- Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer. Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250 (2010).
- Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects. J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).
- Rai, R., Alwani, S., Badea, I. Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications. Polymers. 11 (4), 745 (2019).
- Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery. ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).
- Yin, H., et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles. Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).
- Puri, A., Loomis, K., Smith, B. Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).
- Cullis, P. R., Hope, M. J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).
- Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus. Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).
- Zhao, Y., Huang, L. Lipid nanoparticles for gene delivery. Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).
- Chen, S., et al. Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA. Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).
- Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics. Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).
- Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility. Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).
- Shin, M. D., et al. COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward. Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).
- Thanh Le, T., et al. The COVID-19 vaccine development landscape. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).
- Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. mRNA lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2019).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).
- Suzuki, Y., Ishihara, H. Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid. International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Schmid, J. A. The acidic environment in endocytic compartments. Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).
- Maugeri, M., et al. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nature Communications. 10 (1), (2019).
- Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA. Nanoscale. (45), (2019).
- Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).
- Hafez, I. M., Culis, P. R. Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).
- Evers, M. J. W., et al. State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery. Small Methods. 2 (9), 1700375 (2018).
- Mui, B. L., et al. Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 2 (139), (2013).
- Zukancic, D., et al. The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles. Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).
- NEBioCalculator. New England BioLabs Inc Available from: https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas (2020)
- Kastner, E., et al. High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization. International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).
- Zhigaltsev, I. V., et al. Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing. Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).
- Belliveau, N. M., et al. Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 1 (8), 37 (2012).
- Hassett, K. J., et al. Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines. Molecular Therapy – Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).
- Tanaka, H., et al. The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds. Heliyon. 4 (12), 00959 (2018).
- Singh, J., et al. Nucleic acid lipid nanoparticles. Precision Nanosystems Application Note. , (2018).
