Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות

Published: February 7, 2021 doi: 10.3791/62234
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1,3,4
1Department of Materials Science & Engineering, Stanford University, 2Department of Chemical Engineering, Stanford University, 3Department of Bioengineering, Stanford University, 4Department of Pediatrics - Endocrinology, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה והניסוח של ביו-חומרים הידרוג'ל הידרוג'ל להזרקה, סופראמולקולריים (PNP). יישומים של חומרים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה של תאים ואספקה מודגמים.

Abstract

שיטות אלה מתארות כיצד לנסח הידרוג'לים פולימריים-ננו-חלקיקים (PNP) הניתנים להזרקה לשימוש כביו-חומרים. הידרוג'לים PNP מורכבים משני מרכיבים: תאית שונה הידרופובית כמו פולימר הרשת ננו-חלקיקי מעטפת ליבה בהרכבה עצמית הפועלים כמקשרים צולבים שאינם קוולנטיים באמצעות אינטראקציות דינמיות ורב ערכיות. שיטות אלה מתארות הן היווצרות של חלקיקים אלה בהרכבה עצמית באמצעות nanoprecipitation, כמו גם ניסוח וערבוב של שני המרכיבים כדי ליצור הידרוג'לים עם תכונות מכניות מתכווננות. השימוש בפיזור אור דינמי (DLS) וריולוגיה כדי לאפיין את איכות החומרים המסונתזים מפורט גם הוא. לבסוף, התועלת של הידרוג'לים אלה לאספקת תרופות, ייצוב ביופארמה, אנקפסולציה ואספקה של תאים מודגמת באמצעות ניסויים במבחנה כדי לאפיין שחרור תרופות, יציבות תרמית, ויישוב תאים וכדאיות. בשל תאימות ביולוגית, הזרקה, ותנאי היווצרות ג'ל מתון, מערכת הידרוג'ל זו היא פלטפורמה מתכווננת בקלות המתאימה למגוון יישומים ביו-רפואיים.

Introduction

הידרוג'לים להזרקה הם כלי מתפתח כדי לספק תאים טיפוליים וסמים לגוף בצורה מבוקרת1. חומרים אלה יכולים להיות טעונים עם תרופות או תאים והוא יכול להינתן באופן פולשני מינימלי באמצעות הזרקה ישירה לרקמות שטחיות או על ידי משלוח קטטר לרקמות עמוקות. באופן כללי, הידרוג'לים להזרקה מורכבים מרשתות פולימר נפוחות מים המוצלבות זו לזו על ידי אינטראקציות פיזיות חולפות. במנוחה, crosslinks אלה מספקים מבנה מוצק כמו ג'לים, אבל עם יישום של כוח מכני מספיק crosslinks אלה משובשים באופן זמני, הפיכת החומר למצב דמוי נוזל שיכול בקלות לזרום2. זה אלה תכונות ראולוגיות המאפשרות הידרוג'לים פיזיים לגזירה דק לזרום דרך קטרים מחט קטנה במהלך הזרקה3. לאחר ההזרקה, רשת הפולימר של הרפורמות החומריות, המאפשרת לו לרפא את עצמו וליצור במהירות ג'ל דמוי מוצק במקום4,5. מבנים אלה יכולים לשמש מחסני שחרור איטי עבור תרופות או פיגומים עבורהתחדשות רקמות 6,7. חומרים אלה שימשו ביישומים מגוונים המקיפים טכנולוגיית אספקת תרופות,רפואהרגנרטיבית, אימונו-הנדסה 1,8,9,10,11,12.

הן חומרים טבעיים (למשל, אלגינט וקולגן) והן חומרים סינתטיים (למשל, פולי (אתילן גליקול) (PEG) או פולימרים הידרופיליים דומים) פותחו כחומרי הידרוג'ל להזרקה תואמים ביולוגית13,14,15. חומרים טבעיים רבים מפגינים וריאציה אצווה-לאצווה המשפיעה על הרבייה4,16. חומרים אלה הם לעתים קרובות רגישים לטמפרטורה, ריפוי עם הגעה לטמפרטורות פיזיולוגיות; לפיכך, טיפול בחומרים אלה מציב אתגרים טכניים ולוגיסטיים נוספים17. חומרים סינתטיים מאפשרים בקרה כימית מדויקת יותר ושחזור מעולה, אבל חומרים אלה יכולים לפעמים להיות כפופים לתגובות חיסוניות שליליות המגבילות את תאימותם הביולוגית, תכונה קריטית עבור יישומים טיפוליים vivo6,18,19. מאמצים שנעשו לאחרונה הראו כי ישנם קריטריונים עיצוביים מורכבים רבים המעורבים בהנדסת חומר הידרוג'ל להזרקה, כולל אופטימיזציה של תכונות מכניות, גודל רשת פולימר, רמזים מולקולריים ביו- אקטיביים, מתכלות ואימונוגניות של החומר20,21,22,23,24,25,26. כל הגורמים הללו חייבים להילקח בחשבון בהתאם ליישום של עניין, כלומר פלטפורמה מודולרית, כימית כוונון הוא אידיאלי עבור סיפוק רוחב רחב של יישומים.

השיטות הנוכחיות מתארות את הניסוח ואת השימוש בפלטפורמת הידרוג'ל פולימרית-חלקיקית להזרקה (PNP) המציגה תכונות מכניות ניתנות לכוונון, רמה גבוהה של תאימות ביולוגית ואימונוגניות נמוכה, ומציגה אתרים להטיית רמזים מולקולריים ביו-אקטיביים27,28,29,30,31,32,33. הידרוג'לים PNP אלה מורכבים מפולימרים תאיים שעברו שינוי הידרופובי וננו-חלקיקי קליפת ליבה בהרכבה עצמית הכוללים פולי (אתילן גליקול)-בלוק-פולי (חומצה לקטית) (PEG-PLA)27,34 המקיימים אינטראקציה כדי לייצר רשת סופראמולקולרית. ליתר דיוק, הפולימרים התאיים הידרוקסייפרופילמתיל שעברו שינוי דודציל (HPMC-C12)מקיימים אינטראקציה דינמית עם פני השטח של חלקיקי PEG-PLA ומגשרים בין חלקיקים אלה ליצירת רשת פולימרים זו27,34. אינטראקציות דינמיות ורב-ערכיות אלה מאפשרות לחומרים לגזירה דקה במהלך ההזרקה ולרפא את עצמם במהירות לאחר מתן. רכיבי הידרוג'ל PNP מיוצרים בקלות באמצעות תגובות פשוטות של סיר אחד וההידרוגל PNP נוצר בתנאים מתונים על ידי ערבוב פשוט של שני הרכיבים35. בשל קלות הייצור, פלטפורמת הידרוג'ל זו ניתנת לתרגום בקנה מידה גבוה. התכונות המכאניות וגודל הרשת של הידרוג'ל PNP נשלטים על ידי שינוי אחוז המשקל של רכיבי הפולימר והננו-חלקיקים בניסוח. מחקרים קודמים עם פלטפורמה זו מצביעים על כך שהידרוגלים PNP הם בעלי תאימות ביולוגית, מתכלים ולא אימונוגניים28,30,31. בסך הכל, הידרוג'לים אלה מציגים תועלת רחבה ביישומים ביו-רפואיים המקיפים מניעת הידבקות לאחר הניתוח, הנדסת רקמות והתחדשות, אספקת תרופות מתמשכת ואימונו-הנדסה.

Protocol

לפני תחילת פרוטוקול זה, יש צורך לסנתז HPMC-C12 ו PEG-PLA באמצעות שיטות שפורסמו בעבר27,28,29,30,31,36,37,38.

1. סינתזת ננו-חלקיקים (NP) על ידי ננו-פרציפציה

הערה: סעיף זה מתאר סינתזה של אצווה אחת של NPs, הפקת 250 μL של 20 wt% NPs בתמיסת מאגר (50 מ"ג של פולימר PEG-PLA יבש לכל אצווה). הערות לשינוי קנה מידה של מספר האצוות מסופקות בשלבים הרלוונטיים.

  1. למדוד 50 מ"ג של פולימר PEG-PLA לתוך בקבוקון זכוכית 8 מ"ל נצנוץ ולהוסיף 1 מ"ל של אצטוניטריל. וורטקס להתמוסס לחלוטין.
    הערה: כדי להגדיל את מספר האצוות, בקנה מידה ליניארי שלב זה ולהוסיף את הסכום הכולל של פולימר ממס הדרושים בקבוקון אחד.
  2. הוסיפו 10 מ"ל של מים אולטרה-דקים לבקבוקון זכוכית 20 מ"ל עם בר ערבוב קטן. שים על צלחת ערבוב להגדיר 600 סל"ד.
    הערה: אם קנה המידה של שלב 1.1 השתנה, עדיין יש צורך בבקבוקון נצנצים בודד כדי לזרז אותו עבור כל אצווה שוות ערך. לדוגמה, עבור 200 מ"ג של פולימר מומס ב 4 מ"ל של אצטוניטריל, להכין 4 x 20 בקבוקונים מ"ל.
  3. כדי ליצור NPs על ידי nanoprecipitation, להוסיף 1 מ"ל של פתרון ממס פולימר dropwise לתוך המים באמצעות פיפטה μL 200. מערבבים במשך 2 דקות. בלוק PLA של PEG-PLA אינו מסיס במים, וכתוצאה מכך, NPs מעטפת הליבה יהיה להרכיב את עצמו עם בלוקים PLA הידרופובי כמו הליבה ואת בלוקים PEG הידרופילי כמו הקליפה.
  4. אמת את גודל החלקיקים על-ידי פיזור אור דינאמי (DLS).
    הערה: הליך זה נכתב במיוחד עבור קורא לוחות זמין מסחרית עם חבילת התוכנה המשויכת (ראה טבלת חומרים). לשימוש במכשירים חלופיים, עיין בשיטות ההכנה לדוגמה המתוארות על ידי יצרן המכשיר.
    1. לדלל 20 μL של פתרון NP עם 80 μL של מים אולטרה סגולים (ריכוז ניתוח: 1 מ"ג / מ"ל PEG-PLA NPs). הוסף 30 μL לבאר לצלחת שחורה 384-באר שחורה ברורה (לנתח משולש).
    2. למדוד את הרדיוס ההידרודינמי ואת polydispersity של כל מדגם עם קורא לוחות DLS באמצעות אפשרויות פרוטוקול מוגדרות מראש בחבילת התוכנה. כדוגמה לפרוטוקול טיפוסי, הגדר את הפרמטרים לאיסוף נתונים כדי לרכוש מדידות DLS 5-10 של משך של 2-5 שניות לכל רכישה ולאחר מכן דווח על גודל החלקיקים הממוצע והתפלגות לכל באר, מחושב ממודל חלבונים כדוריים. כדי ליצור הידרוג'לים עם תכונות ראולוגיות עקביות, החלקיקים וכתוצאה מכך צריך להיות 30-50 ננומטר בקוטר הידרודינמי עם polydispersity (PD) < 0.2.
      הערה: אם NPs הם קטנים יותר הרצוי, להשתמש בתמיסה של 75% אצטוניטריל / 25% דימתיל סולפוקסיד (DMSO) בשלב 1.1. הגדלת אחוז DMSO בתמיסת הממס בדרך כלל להגדיל את גודל החלקיקים.
  5. העבר את פתרון NP מבקבוקון הנצנצים של 20 מ"ל ליחידת סינון צנטריפוגלית. צנטריפוגה ב 4500 x g עבור 1 שעות כדי לרכז את פתרון NP כדי <250 μL.
  6. השהה מחדש במאגר הרצוי, כגון מלוחים עם אגירת פוספט (PBS), ל- 20 wt% NPs. Pipette את התוכן של יחידת הסינון הצנטריפוגלית לצינור מיקרוצנטריפוגה מוכתם או בקבוקון נצנוץ זכוכית על איזון מסה. השתמש בכמות קטנה (50-100 μL) של מאגר כדי לשטוף את המסנן ולהבטיח איסוף של כל NPs. הוסף מאגר כדי להגיע למסה כוללת של 250 מ"ג.
    הערה: ניתן לאגד אצוות במהלך ההשעיה החוזרת. פתרונות מלאי NP ניתן לאחסן ב 4 °C (69 °F) במשך כ 1 חודש. אל תקפיא. לאחסון ארוך יותר, ודא את הגודל והפולי-דיספריזנטיות של DLS לפני השימוש.

2. ניסוח הידרוג'ל ואנקפסולציה של תרופות או תאים

הערה: סעיף זה מתאר הכנה של 1 מ"ל של ניסוח הידרוג'ל PNP 2:10, עם 2:10 מציין 2 wt% HPMC-C12 ו 10 wt% NPs (12 wt% פולימר מוצק הכולל) ו 88 wt% פתרון חיץ, פתרון מטען סמים, או השעיית תאים. אחוזי הניסוח יכולים להיות מגוונים להניב הידרוג'לים עם מגוון תכונות מכניות. לדוגמה, הידרוג'לים של PNP 1:5 שימשו לתוצאות הניסוי של יישוב התאים וכדאיות הראו.

  1. הכן פתרון מלאי של 6 wt% HPMC-C12 ב- PBS (או מאגר אחר של בחירה). להתמוסס במשך 48 שעות כדי להבטיח את הפולימר הוא מפוזר לחלוטין.
    הערה: פתרון המלאי HPMC-C12 יציב במשך חודשים בטמפרטורת החדר. עם זאת, אחסון ב 4 מעלות צלזיוס מומלץ לעכב צמיחה מיקרוביאלית.
  2. הוסף 333 מ"ג של 6 wt% HPMC-C12 פתרון מניות לתוך מזרק מנעול לואר 1 מ"ל.
  3. הוסף 500 μL של 20 wt% NP פתרון המניה צינור microcentrifuge. הוסף 167 μL של PBS ופיפט לערבב. באמצעות מחט, למלא עוד 1 מ"ל לואר לנעול מזרק עם פתרון NP מדולל.
    הערה: כדי לטעון מטען סמים, לחשב את הריכוז הסופי הרצוי של התרופה הידרוג'ל ולהעמיס את הסכום המתאים לתוך 167 μL של PBS מעורבב עם NPs. אם בדיקה מולקולרית נחוצה לבדיקת in situ, כגון לניטור יציבות התרופה, לטעון את החללית באופן דומה כמתואר לעיל עבור טעינת מטען סמים. כדי לטעון תאים, לחשב את ריכוז התא הסופי הרצוי הידרוג'ל לטעון את המספר המתאים של תאים לתוך 167 μL של PBS מעורבב עם NPs.
  4. ערבבו את שני רכיבי ההידרוגל (HPMC-C12 ו-NPs) בשיטת ערבוב מרפקים35.
    1. חבר את מחבר מרפק הלואר למזרק המכיל פתרון NP (באופן אופציונלי מכיל גם מטען או תאים של תרופות). לדחוף את פתרון NP דרך המרפק עד המניסקוס גלוי בקצה הפתוח. משוך מעט לאחור וחבר את המזרק המכיל פתרון HPMC-C12.
      הערה: חשוב למזער את האוויר בחיבור המרפק כדי למנוע היווצרות ופיזור של בועות לאורך ההידרוגל במהלך תהליך הערבוב. כאשר מערבבים תאים עם מערבל המרפקים, יש להקפיד לערבב בעדינות רבה יותר כאשר ערבוב מהיר מדי עלול לחשוף את התאים לכוחות גזירה גבוהים, מה שמוביל למוות של תאים.
    2. לשאוב את שני הפתרונות הלוך ושוב דרך מערבל המרפק במשך כ 60 מחזורים עד חומר הומוגני, אטום הידרוג'ל לבן נוצר.
    3. לדחוף את כל נפח הידרוג'ל לתוך מזרק אחד. הסר את המזרק הריק ומשוך את הכוכנה בחזרה על המזרק טעון הג'ל כדי לשחזר חומר ממחבר המרפק. כובע עם מחט או תקע.
      הערה: יש צורך להסביר ~ 300 μL של נפח הידרוג'ל אבוד בשל שטח מת בתהליך ערבוב. לדוגמה, אם 700 μL של נפח הידרוג'ל הסופי רצוי, 1 מ"ל של הידרוג'ל צריך להיות מוכן. ניתן לשנות את תהליך ניסוח ההידרוגל באמצעות מזרקים גדולים יותר. עם זאת, עבור ניסוחים הידרוג'ל נוקשה, כגון 2:10, זה יכול להיות קשה לערבב ולהזריק מזרקים גדולים מ 3 מ"ל בנפח בשל היחס הגובר של חבית מזרק לקוטר מרפק או מחט.
    4. אחסן את ההידרוגל במזרק בטמפרטורת החדר. עם זאת, אם התרופות הם encapsulated, אחסון ב 4 מעלות צלזיוס מומלץ אלא אם כן יצרן התרופה מציין אחרת. אין להקפיא את החומר.

3. מדידת תכונות ראולוגיות של ניסוחים הידרוג'ל

הערה: פרוטוקול זה משמש במיוחד עם קנה המידה המסחרי המוזכר בטבלת החומרים עם גיאומטריית לוח משוננת של 20 מ"מ. לשימוש במכשירים אחרים, עיין בהוראות היצרן להכנת מדגם.

  1. יש לגבש לפחות 700 μL של הידרוג'ל PNP לאפיון ראולוגי.
  2. הזרקת חומר במרכז צלחת קנה המידה המשוננת. הסכום ישתנה בהתאם לפער הגיאומטריה שנבחר. לעיון, פער של 700 מיקרומטר דורש ~ 400-500 μL של חומר.
  3. מנמיכים את הרומטר לפער הקיצוץ (500-1000 מיקרומטר) ומסובבים לאט את צלחת הגרמטר העליונה כשהיא יוצרת מגע עם הידרוג'ל PNP כדי להבטיח שהפער יתמלא באופן שווה ומלא.
  4. בדוק את הטעינה של הידרוג'ל PNP כך שהוא מכסה את כל משטח צלחת rheometer. השתמש מרית או גוזם פלסטיק לקצץ בעדינות ולהסיר כל חומר עודף, כך שיש לו בליטה קלה מאוד מתוך הצלחת.
  5. מנמיכים את הרומטר לפער הגיאומטריה הסופי ומוודאים שהדגימה טעונה בצורה נקייה.
  6. למדוד את התכונות המכאניות של המדגם באמצעות בדיקות תנודה, כגון משרעת או מטאטא תדר, או בדיקות זרימה, כגון מטאטא זרימה או בדיקות צעד.
    הערה: בנתונים הייצוגיים המוצגים, בדיקות משרעת מתנדנדות מופעלות בתדירות קבועה של 10 rad/s. מטאטא תדרים מתנדים מופעלים במתח קבוע של 1%, בתוך המשטר הוויסקואלסטי הליניארי של מטאטא משרעת. מטאטא זרימה נוהלו משיעורי גזירה גבוהים לשיעורי גזירה נמוכים39. כל הבדיקות הושלמו עם 10 נקודות לעשור של נתונים שנאספו בטמפרטורת החדר. ייתכן שיהיה צורך להתאים את פרמטרי הבדיקה בהתאם למאפייני הניסוח. חומרים נוקשים PNP כגון ניסוחים 2:10 לשיעורי גזירה גבוהים יכול לגרום החומר להיפלט מלוחות rheometer, וכתוצאה מכך אפיון מכני לא מדויק, ודורש טעינה מחדש של המדגם בין הבדיקות הבאות. ניתן להשתמש בנתוני הייצוג המוצגים להלן להשוואה במהלך בדיקות בקרת איכות.

4. אפיון שחרור תרופות במבחנה

  1. הכן צינורות נימי על ידי חיתוך צינורות נימי זכוכית לאורך הרצוי. לאטום קצה אחד של כל צינור באמצעות מרית חד פעמית או קצה פיפטה לדחוף כמות קטנה של אפוקסי לתוך קצה הצינור כדי ליצור תקע. אפשר לאפוקסי להגדיר את הזמן המומלץ של היצרן.
    הערה: הצינור חייב להיות קצר יותר מאורך מחט ההזרקה. צינורות בקוטר פנימי של 2-3 מיקרומטר מומלץ כך שאורך של 2.5 אינץ' יכיל לפחות 300 μL של נפח כולל.
  2. לגבש לפחות 500 μL של חומר הידרוג'ל PNP במזרק המכיל את התרופה של עניין. הכינו כל קבוצת מדגם במזרק נפרד.
  3. להזריק 100-200 μL של הידרוג'ל PNP בחלק התחתון של כל צינור נימי באמצעות מחט תת מזרק ארוך (22G, 4 אינץ '). הכינו לפחות שלושה צינורות (משולשים) לכל קבוצת מדגם.
  4. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' מניחים צינורות נימי מלאים בצינור צנטריפוגה חרוט וצנטריפוגה במשך דקה ב 1000 x גרם כדי להבטיח את פני השטח של הידרוג'ל הוא אחיד. ייתכן שיהיה צורך לחזור על צעד זה, לשנות את הזמן והמהירות לפי הצורך כדי להחליק את פני השטח של החומר.
    התראה: ודא שצנטריפוגה מאוזנת היטב.
  5. בזהירות למלא 200-300 μL של PBS על גבי הידרוג'ל בצינור נימי באמצעות מזרק ומחט או פיפטה. אין ליצור קשר או להפריע לפני השטח של ההידרוגל. לאטום את הצינור עם כובע או תקע או לכסות עם לפחות שתי שכבות של סרט פרפין.
  6. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' דגירה דגימות ב 37 °C (69 °F) כדי לדמות בתנאי vivo.
  7. בזהירות להסיר לחלוטין את PBS מכל נימי, מבלי להפריע משטח הידרוג'ל, באמצעות מזרק ומחט בנקודות זמן שנבחרו בהתאם לסולם הזמן הצפוי של שחרור סמים. החלף את אמצעי האחסון שהוסר ב- PBS טרי. לאחסן aliquots בתנאים מתאימים.
    הערה: ניתן למטב את הכרכים המומלצים ונקודות הזמן בשלבים 4.3, 4.5 ו- 4.7 כדי ללכוד שחרור תרופות במבחנה לאורך טווח של צירי זמן, תלוי כמה סמים נטענים בחומר וכמה מהר הוא משחרר לתוך supernatant. מדגם של נקודות זמן נבחרות יכול להיות 6 שעות, 1 יום, 3 ימים, 1 שבוע ו 2 שבועות עבור תרופה משחררת לאט. Aliquots ניתן גם לנתח כפי שהם נרכשים ולא מאוחסנים.
  8. בסיום המחקר, לנתח aliquots עם שיטה מתאימה כגון ELISA, HPLC או בדיקת פלואורסצנטיות כדי לכמת את כמות התרופה שוחרר בכל נקודה בכל נקודה40,41,42. שיטת הגילוי המתאימה תשתנה בהתאם לתרופה המעניינת.
    הערה: מחקרי שחרור במבחנה שימושיים להשוואת שחרור בין ניסוחים הידרוג'ל שונים או מטען סמים. ציר הזמן לשחרור במבחנה אינו מציין לעתים קרובות ישירות סרגל זמן צפוי של שחרור ב- vivo.

5. אפיון היציבות התרמית של אינסולין עטוף ג'ל

  1. יש לגבש לפחות 1.2 מ"ל של הידרוג'ל PNP לכל קבוצת מדגם. בעקבות ההליך המתואר בסעיף 2.3, לטעון הן אינסולין (מטען סמים) ו thioflavin T (ThT) (בדיקה מולקולרית) לתוך הידרוג'ל PNP.
    הערה: המנגנון העיקרי של צבירה, ולכן, השבתה של אינסולין היא באמצעות היווצרות של סיבי עמילואיד. ThT הוא בדיקה מולקולרית מתאימה כי זה מייצר אות פלואורסצנטיות חזק בנוכחות סיבים עמילואיד, המאפשר ניטור באתרו של צבירת אינסולין. בהתאם למטען התרופה של עניין, צבירה עשויה להיות במעקב באמצעות שיטות שונות. עבור הנתונים הייצוגיים המוצגים, אינסולין נטען לריכוז סופי של 6.7 או 10 מ"ג / מ"ל ו- ThT לריכוז סופי של 25 מיקרומטר.
  2. באמצעות מחט 21 G, להזריק 200 μL של הידרוג'ל PNP לכל באר לתוך צלחת שחורה 96-באר. יש למדוד כל קבוצת מדגם לפחות משולשת. צלחת חותם עם חותם צלחת דבק אופטי ברור כדי למנוע אידוי.
  3. הכנס צלחת לקורא לוח המצויד בבקרת טמפרטורה, טלטול ותכנות קריאה קינטי והתחל לקרוא פרוטוקול. נתונים מייצגים נרכשו באמצעות קורא לוחות זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) באמצעות התנאים הבאים:
    1. תנאי הזדקנות לחוצים: טלטול ליניארי מתמשך (410 סל"ד, 5 מ"מ) ב-37 מעלות צלזיוס.
    2. רכישת נתונים: עירור/פליטה 450 ננומטר/482 ננומטר במרווחים של 20 דקות
      הערה: אם קורא צלחות עם בקרת טמפרטורה, שייקר ויכולות קריאה קינטית אינו זמין, ניתן להניח את הצלחת על צלחת שייקר באינקובטור ולקרוא ידנית באורך גל מעל בנקודות זמן נבחרות.
  4. התווה נתונים כאות פלואורסצנטי ממוצע לאורך זמן עבור כל קבוצה. ניתן לכמת זמן לצבירה על ידי הגדרת סף אות שרירותי43.
    הערה: עבור הנתונים הייצוגיים המוצגים להלן, הסף הוגדר כ- 750,000 יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות (AFU). ערך זה נבחר להיות מעל לקו הבסיס הנמדד ועדיין ללכוד מספיק את תחילת הצבירה המצוינת על ידי עלייה חדה באות פלואורסצנטי.
  5. סיים את ההסתעפויה כאשר דגימות צוברות או מתחילות להתייבש באופן חזותי.

6. הערכת כדאיות התא

  1. לנסח לפחות 2 מ"ל של הידרוג'ל PNP המכיל את ריכוז התא הרצוי בעקבות הפרוטוקולים לעיל (בדרך כלל 1 - 5 x 106 תאים / מ"ל). הכינו כל קבוצת מדגם במזרק נפרד.
  2. באמצעות מחט 21G, להזריק 150 μL PNP הידרוג'ל לתוך כל באר בצלחת 96-באר תחתונה ברורה; כל באר היא שכפול אחד. לכל קבוצה לדוגמה צריכים להיות 3-5 שכפולים לכל נקודת זמן. צנטריפוגה הצלחת ב 50 x גרם במשך 2 דקות כדי להפיץ את הידרוג'ל באופן שווה בבאר.
  3. הוסף 100 μL של מדיית התא המתאימה על גבי הידרוג'ל. הסר מדיה זו מדי יום והוסף מדיה חדשה של 100 μL.
  4. ביום 1, הסר את המדיה מעל ההידרוגל עבור השכפולים המיועדים עבור נקודת זמן זו עבור כל קבוצת מדגם. הוסף 50 μL של 2 מ"מ קלצ'ין AM פתרון על גבי הידרוג'לים. דגירה במשך 30 דקות.
    הערה: ניתן להשתמש ב- Calcein AM כדי לזהות ולתייג תאים חיים. בתאים חיים, הקלצין AM שאינו פלואורסצנטי מומר לקלצין פלואורסצנטי ירוק, על ידי אסטראזות תאיות לאחר אצטוקסימתיל אסתר הידרוליזה.
  5. צלם את מרכז כל באר בצלחת של 96 באר באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי. סקר שטח של לפחות 300 מיקרומטר2 עם מחסנית z פורש לפחות 150 מיקרומטר. השתמש בהגדרות אורך גל confocal כדי ללכוד את הפלואורסצנטיות של calcein (עירור / פליטה: 495 ננומטר / 515 ננומטר).
  6. חזור על שלב 6.4 ו- 6.5 עבור כל נקודת זמן עוקבת לפי הצורך.
  7. כדי לנתח כל תמונה, כווץ את כל תמונות הערימה z לתמונת עוצמה מרבית של מישור יחיד באמצעות FIJI או תוכנה דומה. כימתו את מספר התאים הפלואורסצנטיים בכל תמונה. היחס בין מספר התאים הפלואורסצנטיים בכל נקודת זמן בהשוואה למספר התאים הפלואורסצנטיים ביום הראשון הוא כדאיות התאים היחסית בהידרוגלים של PNP.

7. הערכת יישוב תאים

  1. לחשב את מספר התאים הדרושים כדי לנסח 500-700 μL של הידרוג'ל PNP בריכוז הסופי של 5 x 106 תאים / מ"ל. להשעות תאים 1 מ"ל של PBS בריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל. תאי כתם על ידי הוספת 50 μL של 2 מ"מ calcein AM. דגירה התאים עם הצבע במשך 10 דקות.
  2. תאי צנטריפוגה בתנאים המתאימים, להסיר את PBS ו resuspend התאים בנפח של PBS צורך ליצור 500-700 μL של הידרוג'ל PNP הרצוי.
    הערה: המהירות ומשך הזמן המומלצים לצנטריפוגה של כל סוג תא ספציפי מסופקים בדרך כלל בתיעוד המוצר.
  3. לנסח 500-700 μL של הידרוג'ל PNP עם תאים מוכתמים (5 x 106 תאים / מ"ל) בעקבות סעיף פרוטוקול 2.
  4. באמצעות מחט 21G, להזריק 100-200 μL של הידרוג'ל PNP המכיל את התאים המוכתמים בתחתית cuvette. יש לבצע שלושה שכפולים עבור כל דגימה. להזיז את המחט קדימה ואחורה בתוך cuvette תוך הזרקת כדי למנוע היווצרות בועה.
  5. מיד (זמן t = 0), תמונה cuvettes שוכב על הצד שלהם על כל אזור מלבן cuvette שטוח בבסיס cuvette. השתמשו ביכולות סריקת האריחים הקונפוקלית כדי לדמות את כל אזור הבאר ולצלם מחסנית z בתלת-ממד בעומק של 100 מיקרומטר. להדמיה מאוחרת יותר, או להשתמש בתוכנת מיקרוסקופ confocal לתפור יחד את כל האריחים בודדים ולבצע הקרנה בעוצמה מקסימלית כדי ליצור תמונה אחת של השטח הגדול או להשתמש בתוכנת FIJI במחשב אישי44,45.
  6. לאחר ההדמיה, לעמוד cuvettes זקוף.
  7. תמונה ב 1 שעה ו 4 שעות כדי לבחון אם התאים התיישבו הידרוג'ל או אם הם נשארים מושעים.
    הערה: נקודות זמן אלה הן הצעות וניתן לשנות אותן לפי הצורך.
  8. כדי לנתח כל תמונה, כווץ את כל תמונות הערימה z לתמונת עוצמה מרבית של מישור יחיד. באמצעות FIJI או תוכנה דומה, לכמת את התפלגות התא על ידי מדידת עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך הפרופיל האנכי המרכזי של cuvette כדי לקבוע את מידת ההתיישבות.

Representative Results

ייצור ואפיון הידרוג'ל PNP
הידרוג'לים של PNP נוצרים באמצעות ערבוב של שני המרכיבים העיקריים - פולימרים HPMC שעברו שינוי הידרופובי וננו-חלקיקי PEG-PLA(איור 1a). מטען טיפולי משולב בקלות רבה לתוך החיץ הנוסף המשמש לדלל את רכיב הננו-חלקיקים לפני הכנת הידרוג'ל. לאפיון ביו-רפואי במורד הזרם, נוח להשתמש בשיטת ערבוב מרפקים המאפשרת ערבוב פשוט וניתן לשחזור של שני הרכיבים (איור 1b). לאחר ערבוב הולם, ההידרוגל אמור להרגיש יציב במזרק, אך להיכנע תחת לחץ ולהולל ממחט סטנדרטית (21G מוצגת)(איור 1c). לאחר ההזרקה, ההידרוגל צריך להגדיר במהירות לתוך חומר מוצק כמו המתנגד זרימה מכוח הכבידה. כדי לאפיין באופן מלא את הידרוג'ל ולהבטיח מוצרי אצווה-לאצווה עקביים, יש לנתח דגימות באמצעות מספר ניסויים שונים על מד קנה אופן. ניתן יהיה להבחין בקלות ביכולות ההחלקה והריפוי העצמי של הג'ל באמצעות פרוטוקול סריקת זרימה ופרוטוקול גזירה חורגת, בהתאמה (איור 2a,b). עבור ג'לים נוקשים יותר, כגון ניסוח 2:10, המשתמש צריך לחפש צמיגות כדי להקטין לפחות שני סדרי גודל במהלך לטאטא זרימה כמו קצב הגזירה הוא גדל מ 0.1 ל 100 s-1, אשר מדמה את התנאים המכניים במהלך ההזרקה. פרוטוקול גזירה שלב צריך לחשוף ירידה בסדר גודל צמיגות תחת שלבי גזירה גבוהה, וחזרה מהירה (<5 s זמן התאוששות) לצמיגות בסיסית במהלך שלבי גזירה נמוכים. אפיון מודולי האחסון וההפסד באמצעות ניסוי ניקוי תדר גזירה מתנדנד במשטר הוויסקואלסטי הליניארי אמור לחשוף מאפיינים דמויי מוצק בטווחי תדרים בטווחים שבין 0.1-100 rad s-1 (איור 2c). בפרט, בדרך כלל לא צריך להיות מוצלב של אחסון גזירה ומודולי אובדן כי הוא נצפה בתדרים נמוכים עבור ניסוחים נוקשים כמו הידרוג'לים 2:10. אירוע מוצלב כזה עשוי להצביע על בעיות באיכות החומרים ההתחלתיים, או הפולימר HPMC או PEG-PLA שהשתנה, או הגודל והפיזור של חלקיקי PEG-PLA. יש לציין כי צפוי אירוע קרוסאובר לניסוחים הידרוג'ל חלשים יותר, כגון הידרוג'ל 1:5. מטאטא משרעת גזירה תנודה על הידרוג'לים PNP לחשוף כי החומרים אינם מניבים עד ערכי מתח גבוה מוחלים, המציין חומרים אלה יש מתח תשואה, כמות סף של מתח הנדרש עבור החומר לזרום.

אפיון קינטיקה שחרור מן הידרוג'לים PNP
צעד חיוני בעיצוב ג'לים PNP לאספקת תרופות הוא אפיון קינטיקה שחרור סמים מניסוח נבחר. ישנן מספר טכניקות לכך, אך מתודולוגיית במבחנה פשוטה מספקת נתונים שימושיים במהלך פיתוח ניסוח מוקדם (איור 3a). שינוי תכולת הפולימר של הידרוג'ל PNP באמצעות לווסת את כמות HPMC-C12 או NPs היא הדרך הפשוטה ביותר לכוונן את התכונות המכאניות ואת גודל הרשת של הידרוג'לים אלה, אשר יכולה להיות השפעה ישירה על פיזור המטען באמצעות רשת הפולימר וקצב השחרור מהחומרים (איור 3b). עבור מטען גדול יותר מגודל הרשת הדינמי (כלומר, משקל מולקולרי גבוה או רדיוס הידרודינמי גדול), החוקרים צריכים לצפות לשחרור איטי בתיווך פירוק של מטען ממחסן ההידרוגל. ניסוחים עם גדלי רשת דינמיים גדולים או שווים לגודל המטען יאפשרו שחרור בתיווך דיפוזיה שניתן לתאר באמצעות דגמים מסורתיים של דיפוזיה מטען ושחרור46,47,48,49. בהתבסס על הצורה של עקומת השחרור, החוקרים יכולים לעצב מחדש את ההידרוגל כדי לכוון אותו לכיוון איטי יותר (למשל, להגדיל את תכולת הפולימר) או מהר יותר (למשל, להקטין את תוכן הפולימר) שחרור.

הערכת יציבות המטען הטיפולי
קביעת היציבות של המטען הטיפולי בניסוח הידרוג'ל היא קריטית לפני תחילת מחקרים פרה-קוליניים או תאיים. בהשוואה לשיטות סינתטיות אחרות לאנקפסולציה של תרופות, הידרוג'לים של PNP משלבים מטען בצורה עדינה על ידי ערבוב לתוך החומר בתפזורת, ולא סביר כי אנקפסולציה תפגע במטען. מחקרים אלה מצביעים על כך שהידרוג'ל PNP יכול גם לייצב מטען הרגיש לחוסר יציבות תרמית, כגון אינסולין, הארכת חיי מדף משמעותית והפחתת ההסתמכות על אחסון והפצה של קרים (איור 4). חשוב להעריך את מצב המטען מיד לאחר אנקפסולציה לתוך הידרוג'ל, כמו גם לאחר תקופות ממושכות של אחסון. נתונים אלה מראים כי האינסולין נשאר יציב הידרוג'ל לאחר 28 ימים של אחסון תחת מתח תרמי ומכאני מתמשך, באמצעות בדיקת פלואורסצנטיות פשוטה למדידת צבירת אינסולין. טכניקה חלופית במקרים שבהם בדיקה מתאימה של צלחת אינה זמינה תהיה לבצע מדידות דיכרואיזם מעגליות של המטען, אשר שימושי במיוחד לקביעת המבנה המשני של תרופות חלבון.

קביעת הכדאיות והפיזור של התאים בהידרוגלים של PNP
תאים טיפוליים רבים דורשים מוטיבים הידבקות להישאר קיימא, ובכך הכללה של מוטיבים integrin כמו ארגינין-גליצין אספרטידים (RGD) פפטידים הוא צעד חשוב בהתאמת הידרוג'לים PNP לטיפולים הסלולר50. PEG מודולרי-PLA פולימר המרכיבים את NPs מאפשר תפקוד כימי של קורונה PEG באמצעות פשוט "לחץ" כימאים28,51. בדוגמה זו, פפטידים RGD דבק תאים היו מחוברים פולימר PEG-PLA כדי לקדם את מעורבות התא עם מבנה הידרוג'ל PNP. ניסוחים חסרים אתרי הידבקות יהיו בעלי כדאיות נמוכה לתאים, שכן תאים שעברו אנקפסולציה אינם מתרבים בהשוואה לתאים עטופים בניסוחים עם מוטיבים אלה של הידבקות (איור 5a, b). תאים שעברו אנקפסולציה יכולים להיות מסומנים בקלסין AM או בצבע פלואורסצנטי מתאים אחר (למשל, CFSE) כדי להקל על ספירת תאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. במהלך אופטימיזציה, יש להשוות את הכדאיות להידרוגלים PNP ללא שינוי כדי להבטיח ניסוחים פונקציונליים integrin מספקים כדאיות משופרת והתפשטות. אם ניסוחים פונקציונליים integrin מספקים יעילות דומה הידרוג'לים ללא שינוי, זה עשוי להצביע על כשל בכימיה ההטיה המשמשת לשלב את מוטיבים הידבקות.

החוקרים צריכים לצפות תאים encapsulated להיות מפוזרים באופן שווה דרך מדיום הידרוג'ל בעת שימוש ניסוח הידרוג'ל מתאים. זה יאפשר מינון עקבי וצפוי של תאים במהלך ניהול הידרוג'ל צריך לתרגם שימור מקומי של תאים הידרוג'ל לאחר הממשל. ניתן לקבוע בקלות את התפלגות התאים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיות פלואורסצנטיות. תאים יכולים להיות מסומנים בצבע מתאים ולאחר מכן תמונה באמצעות מיקרוסקופיה confocal. ניתן להעריך את התמונות באופן חזותי (איור 5c) וגם באופן כמותי (איור 5d) באמצעות תוכנת ImageJ למדידת עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת לאורך הציר האנכי של התמונה (או לאורך הציר שיקומי עקב כוח המשיכה). אם ניסוח ההידרוגל חלש מכדי לתמוך בתאים בהשעיה לאורך פרקי זמן ממושכים, תתרחש התיישבות תאים, כפי שנצפה בניסוח 1:1 באיור 5. הגדלת תכולת הפולימר יכולה לפתור בעיות בפיזור תאים לא הומוגני עקב התיישבות.

Figure 1
איור 1: הידרוג'לים פולימריים-ננו-חלקיקיים (PNP) נוצרים בקלות על-ידי ערבוב שני רכיבים. (א) המרכיב הראשון הוא פתרון של תאית הידרוקסיפרופילמתיל (HPMC-C12)שעברו שינוי דודציל , והמרכיב השני הוא פתרון של חלקיקי פולי (אתילן גליקול)-בלוק-פולי (חומצה לקטית) (PEG-PLA) חלקיקים יחד עם כל מטען טיפולי. ערבוב עדין של שני רכיבים אלה מניב הידרוג'ל להזרקה, שבו הפולימרים HPMC-C12 מקושרים פיזית על ידי אינטראקציות דינמיות ורב ערכיות עם חלקיקי PEG-PLA. (ב)צילום הוכחת ניסוח ג'ל על ידי ערבוב עם שני מזרקים, כל אחד מכיל מרכיב אחד של הידרוג'ל PNP. על ידי חיבור שני המזרקים עם מחבר מרפק מנעול Luer, ניתן לערבב בקלות את שני הרכיבים בתנאים סטריליים כדי להניב הידרוג'ל ללא בועה טעון מראש לתוך מזרק לשימוש מיידי. פתרון NP צבוע בכחול לצורך הדגמה. (ג)הדגמה של הזרקת הידרוג'לים PNP והתמצקותם מחדש. (i) הידרוג'ל PNP במזרק עם מחט 21G מחובר. (ii) ההזרקה ממקמת את ההידרוגל תחת גזירה אשר שוברת זמנית את האינטראקציות בין פולימר לננו-חלקיקים, ויוצרת עקביות דמוית נוזל. (iii) לאחר ההזרקה, אינטראקציות פולימר-חלקיקים דינמיות במהירות רפורמה, המאפשר הידרוג'ל לרפא את עצמו לתוך מוצק. (iv) הידרוג'ל מוצק אינו זורם תחת כוחות חלשים יותר מאשר מתח התשואה שלה, כגון כוח הכבידה. הידרוג'ל PNP צבוע כחול לצורך הפגנה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: אפיון ראולוגי של שתי ניסוחים הידרוג'ל PNP. ניסוחים מסומנים כפולימר wt.%: NP wt.%. (א) זרימת גזירהיציבהגורפת משיעור גזירה נמוך עד גבוה של הידרוג'לים PNP. צמיגות כפונקציה של קצב גזירה מאפיינת תכונות דלילות גזירה. (ב)צמיגות כפונקציה של שיעורי גזירה מתנדנדים בין שיעורי גזירה נמוכים (רקע לבן; 0.1 s-1)לשיעורי גזירה גבוהים (רקע אדום; 10 s-1) המדגימים תכונות ריפוי עצמי של הידרוג'לים PNP. שיעורי גזירה מוטלים על 30 שניות כל אחד. (ג)מודולוס אחסון אלסטי G′ ומודולוס הפסד צמיג G" כפונקציה של תדירות ב 1% זן קבוע עבור ניסוחים שונים הידרוג'ל PNP. (ד)משרעת מטאטא בתדירות קבועה של 10 rad/s כדי לאפיין מודולוס אחסון אלסטי G′ ו modulus Gאובדן צמיג " של הידרוג'לים PNP כפונקציה של מתח. אפיון ראולוגי זה יכול לשמש כהשוואה לבקרת איכות. נתון זה הותאם מ- Grosskopf ואח '28אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: אין ויטרו שחרור של אלבומין סרום שור (BSA) מ PNP הידרוג'לים. ניסוחים מסומנים כפולימר wt.%: NP wt.%. (א)סכמטי המתאר את פרוטוקול שחרור במבחנה הניסיוני. Aliquots מוסרים מצינורות נימי הידרוג'ל PNP טעון לאורך זמן. (ב)המהדורה במבחנה של BSA מ 1:10 PNP, 2:5 PNP ו 2:10 PNP דיווחו כמו המסה שנאסף על ידי נקודת הזמן שצוינה מחולק על ידי המסה הכוללת שנאספה במהלך assay (נתונים המוצגים כ ממוצע ± SD; n = 3). BSA זוהה באמצעות מדידות ספיגה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: יציבות תרמית של אינסולין עטוף הידרוג'ל PNP על ידי ThT assay. ניסוחים מסומנים כפולימר wt.%: NP wt.%. אינסולין עטוף הן 1:5 ו 2:10 PNP הידרוג'ל נשאר ללא הפרדה במשך 28 ימים בתנאי הזדקנות הדגיש של 37 °C (69 °F) ותסיסה מתמדת. זמן צבירת אינסולין מנוסח PBS היה 20 ± 4 שעות (ממוצע ± SD, סף צבירה 750,000 AFU). נתונים המוצגים כממוצע של n = 4 משכפלים ניסיוניים (AFU, יחידות פלואורסצנטיות שרירותיות). נתון זה הותאם מ- Meis et al.38אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: כדאיות התא והתיישבות התאים בהידרוגלים של PNP. (a,b) מחקרי כדאיות תאים בהידרוגלים PNP עם תאי גזע מסנצ'מיליים אנושיים (hMSCs). (א)תמונות מייצגות של hMSCs קיימא ב 1:5 הידרוג'לים PNP עם ובלי תא דבק ארגינין-גליצין-אספרטי (RGD) מוטיב מצומדים PEG-PLA NPs. hMSCs היו מוכתמים קלצין במשך 30 דקות לפני הדמיה confocal. סרגל קנה המידה מייצג 100 מיקרומטר. (b) הכדאיות של התא ביום 6 מוגדרת כמספר תאים פלואורסצנטיים בתמונה יחסית למספר התאים הפלואורסצנטיים ביום 1 (נתונים המוצגים כ ממוצעים ± SD; n = 3). (ג,ד) אנקפסולציה של תאים וניסויי יישוב עם רכיבי HMSC. (ג) תמונות בעוצמה מרבית של רכיבי HMSCs מוכתמים ב- 1:1 PNP (שורה עליונה) ו- 1:5 PNP הידרוג'ל (שורה תחתונה) לרוחב 4 שעות לכימות שקיעת התאים. סרגל שינוי קנה המידה מייצג 1 מ"מ.(ד)עוצמת הפיקסל האופקי הממוצעת של רכיבי hMSCs לאורך הפרופיל האנכי של ההידרוגל. נתון זה הותאם מ- Grosskopf ואח '28אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

הידרוג'לים פולימריים-ננו-חלקיקיים (PNP) מיוצרים בקלות ומאפשרים אספקה מקומית ארוכת טווח של תאים ותרופות טיפוליים באמצעות ניהול זעיר פולשני באמצעות הזרקה ישירה או משלוח קטטר. פרוטוקולים אלה מתארים את ניסוח הידרוג'לים PNP ואת שיטות האפיון להבטחת איכות החומרים וכתוצאה מכך. הידרוג'ל PNP סופראמולקולרי ניתנים לייצור ונוצרים באמצעות ערבוב פשוט של פולימרים תאיים מותאמים וננו-חלקיקי קליפת ליבה פולימריים. השיטות הנוכחיות מתארות נהלים פשוטים ליצירת ג'לים טעונים מראש במזרקים באמצעות פרוטוקולי ערבוב מרפקים פשוטים. באמצעות מדדי בקרת איכות של כל אחד מחלקי הרכיבים, כגון DLS לניטור הגודל וההפצה של NP, ניתן לנסח באופן משחזר חומרי הידרוג'ל PNP בעלי תכונות ראולוגיות עקביות. באמצעות שינוי הכמות של HPMC-C12 או NPs, ניתן לווסת את גודל רשת שינוי נוקשות של הידרוג'ל PNP וכתוצאה מכך. מאפיינים אלה יכולים להיות מכווננים בצורה הטובה ביותר כדי להתאים בצורה הטובה ביותר ליישום ביו-רפואי מסוים, ועם השיטות הריאולוגיות המפורטות כאן החוקרים יכולים לאפיין את תכונות דילול הגזירה וריפוי עצמי של הידרוג'לים PNP כפי שהם לייעל את הפלטפורמה עבור היישומים הספציפיים שלהם. שיטות למחקרי שחרור במבחנה מתוארות גם; חוקרים יכולים להשתמש במחקרים אלה כדי לאפיין את ציר הזמן היחסי של שחרור תרופות מעניינות, ליידע את העתיד במחקרים vivo. באמצעות מחקרי יציבות, החוקרים יכולים גם להעריך את היכולת של חומרים אלה כדי לסייע בשמירה על המבנה הביולוגי והיציבות של biotherapeutics רגיש לאורך זמן ומזג אוויר קיצוני, עם יישומים פוטנציאליים משכנעים כדי להפחית את התלות בשרשרת הקור של biotherapeutics. לבסוף, עם מבחני כדאיות תאים פשוטים, ניתן להעריך צמיחת תאים והגירה בתוך חומרי PNP, עם יישומים פוטנציאליים בטיפולים ופיגומים בתאים.

הקבוצה שלנו מצאה יישומים משכנעים רבים עבור פלטפורמת הידרוג'ל PNP27. הידרוג'לים PNP שימשו לאספקה איטית של חיסונים subunit, המאפשר פרופילי שחרור קינטי תואם של אנטיגנים ואדג'ובנטים כדי להגביר את הגודל, משך, ואיכות התגובה החיסונית הומוריסטי31. הידרוג'לים PNP נמצאו יש גודל רשת קטן יותר מאשר הידרוג'לים הנפוצים ביותר, ולכן הם יעילים בהאטת דיפוזיה לאט משחרר מטען מולקולרי. תכונות דבקות הרקמה הייחודית ואת המאפיינים המכניים של הידרוג'לים PNP נוצלו גם כדי ליצור מחסומים פיזיים כדי למנוע הידבקויות הנובעות מניתוח על ידי ריסוס הידרוג'לים על פני שטח גדולים של איברים לאחר ניתוח30. הידרוג'לים PNP הוכחו גם להיות כלי רכב יעילים אספקת תאים, ואת המאפיינים המכניים למעשה להגן על התאים מפני הכוחות המכניים המתרחשים מחט המזרק במהלך ההזרקה, שיפור הכדאיות התא29. כאשר NPs הם מצומדים עם פפטיד דבק תאים, תאים יכולים לצרף ולעסוק עם מטריצת PNP להישאר קיימא. באמצעות גישה זו, הידרוג'לים PNP הוכחו לשפר את השמירה המקומית של תאי גזע מוזרקים לעומת שיטות באמצעות כלי רכב נוזליים28. בנוסף, הידרוג'לים PNP הוכחו למנוע הצטברות תרמית של אינסולין encapsulated, אפילו בתנאי הזדקנות לחוצים קשים, מה שמרמז כי חומרים אלה עשויים להיות מסוגלים להפחית את הצורך בקירור תרופות רגישות לטמפרטורה38.

בסך הכל, המתודולוגיות המתוארות כאן יאפשרו לקבוצות מחקר לפברק ולחקור הידרוג'לים PNP כמו biomaterial. פרוטוקולים אלה מספקים את טכניקות הסינתזה בקנה מידה מעבדה כדי לפברק מספיק חומר הידרוג'ל להמשיך הן במבחנה והן במחקרים vivo. המחקרים שתוארו לעיל מצביעים על כך שהצליבות הדינמיות של חומרים אלה מאפשרות לו להתאים למגוון יישומים ביו-רפואיים על ידי מתן תנועתיות אקטיבית של תאים לכודים תוך הגבלת דיפוזיה פסיבית של מטען מולקולרי. צפוי כי החוקרים ימצאו את פלטפורמת PNP כלי נגיש ורב עוצמה כדי לשפר את התוצאות הקליניות באמצעות אספקת תרופות מבוקרת וללמוד מנגנונים ביולוגיים בסיסיים כגון גיוס תאים mechanobiology.

Disclosures

למחברים האלה אין מה לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך כספית על ידי המרכז לאימונולוגיה של מערכות אנושיות עם קרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1113682) וקרן ביל ומלינדה גייטס (OPP1211043). ג.M.M נתמך על ידי מלגת בוגרי סטנפורד ומלגת סטנפורד ביו-אקס ויליאם ולינדה לנווט. A.K.G. הוא אסיר תודה על מלגת מחקר בוגרי הקרן הלאומית למדע ומלגת Gabilan של מלגת בוגר סטנפורד למדע והנדסה. S.C נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר F32CA247352. המחברים גם רוצים להכיר בחום חברי מעבדת אפל כולל ד"ר גילי רות, ד"ר אנתוני יו, ד"ר לינדזי סטייפלטון, ד"ר הקטור לופז הרננדז, ד"ר אנדריאה ד 'אקינו, ד"ר ג'ולי Baillet, סלין ליונג, בן או, אמילי מייני, אמילי גייל וד"ר אנטון סמית על המאמץ והזמן שלהם לעזור מעבדת אפל לפתח פרוטוקולים אלה לאורך השנים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
21G needles BD 305165 PNP hydrogel injection
22G, 4 in hypodermic needles Air-Tite N224 In vitro release studies
384-well plates, black, clear bottom Corning 3540 Dynamic light scattering (DLS)
96-well plates, black Fisher Scientific 07-200-627 Biostability studies
96-well plates, clear Corning 3599 Cell viability and settling studies
Calcein AM Thermo Fisher Scientific C3100MP Cell viability and settling studies
Capillary tubes McMaster-Carr 8729K66 In vitro release studies
Centrifugal filter units Fisher Scientific UFC901024 NP concentration
Cuvettes Millipore Sigma BR759015-100EA Cell viability and settling studies
DLS Plate Reader Wyatt Technology DynaPro II Plate Reader Dynamic light scattering (DLS)
Epoxy VWR International 300007-392 (EA) In vitro release studies
Hypodermic needles Air-Tite 8300015027 In vitro release studies
Luer elbow connector Cole-Parmer EW-30800-12 PNP hydrogel formulation
Luer lock syringe Fisher Scientific 14-955-456 PNP hydrogel formulation
Phosphate Buffered Saline (1x) Fisher Scientific 10010049 PNP hydrogel formulation
Plastic Spatula Thomas Scientific 1229F13 Rheological characterization
Plate Reader BioTek Synergy H1 Hybrid Multi-Mode Plate Reader Biostability studies
Plate seals Excel Scientific TS-RT2-100 Biostability studies
Recombinant human insulin Gibco A11382II Biostability studies
Rheometer TA Instruments DHR-2 Rheometer Rheological characterization
Thioflavin T Sigma-Aldrich T3516-5G Biostability studies

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mandal, A., Clegg, J. R., Anselmo, A. C., Mitragotri, S. Hydrogels in the clinic. Bioengineering Translational Medicine. 5 (2), 10158 (2020).
  2. Appel, E. A., del Barrio, J., Loh, X. J., Scherman, O. A. Supramolecular polymeric hydrogels. Chemical Society Reviews. 41 (18), 6195-6214 (2012).
  3. Mann, J. L., Yu, A. C., Agmon, G., Appel, E. A. Supramolecular polymeric biomaterials. Biomaterials Science. 6 (1), 10-37 (2018).
  4. Foster, A. A., Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. The diverse roles of hydrogel mechanics in injectable stem cell transplantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 15, 15-23 (2017).
  5. Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue Engineering Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
  6. Marquardt, L. M., Heilshorn, S. C. Design of injectable materials to improve stem cell transplantation. Current Stem Cell Reports. 2 (3), 207-220 (2016).
  7. Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Current Opinion in Biotechnology. 24 (5), 841-846 (2013).
  8. Marquardt, L. M., et al. Designer, injectable gels to prevent transplanted Schwann cell loss during spinal cord injury therapy. Science Advances. 6 (14), 1039 (2020).
  9. Stephan, S. B., et al. Biopolymer implants enhance the efficacy of adoptive T-cell therapy. Nature Biotechnology. 33 (1), 97-101 (2015).
  10. Tuladhar, A., et al. Injectable hydrogel enables local and sustained co-delivery to the brain: two clinically approved biomolecules, cyclosporine and erythropoietin, accelerate functional recovery in rat model of stroke. Biomaterials. 235, 119794 (2020).
  11. Pakulska, M. M., Miersch, S., Shoichet, M. S. Designer protein delivery: From natural to engineered affinity-controlled release systems. Science. 351 (6279), (2016).
  12. Gupta, D., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Fast-gelling injectable blend of hyaluronan and methylcellulose for intrathecal, localized delivery to the injured spinal cord. Biomaterials. 27 (11), 2370-2379 (2006).
  13. Verbeke, C. S., Mooney, D. J. Injectable, pore-forming hydrogels for in vivo enrichment of immature dendritic cells. Advanced Healthcare Materials. 4 (17), 2677-2687 (2015).
  14. Tous, E., Purcell, B., Ifkovits, J. L., Burdick, J. A. Injectable acellular hydrogels for cardiac repair. Journal of Cardiovascular Translational Research. 4 (5), 528-542 (2011).
  15. Zhao, X., et al. Antibacterial anti-oxidant electroactive injectable hydrogel as self-healing wound dressing with hemostasis and adhesiveness for cutaneous wound healing. Biomaterials. 122, 34-47 (2017).
  16. Johnson, T. D., Christman, K. L. Injectable hydrogel therapies and their delivery strategies for treating myocardial infarction. Expert Opinion on Drug Delivery. 10 (1), 59-72 (2013).
  17. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Seminars in Cancer Biology. , Elsevier. 378-386 (2005).
  18. Hickey, J. W., et al. Engineering an artificial T-cell stimulating matrix for immunotherapy. Advanced Materials. 31 (23), 1807359 (2019).
  19. Baumann, M. D., et al. An injectable drug delivery platform for sustained combination therapy. Journal of Controlled Release. 138 (3), 205-213 (2009).
  20. Trappmann, B., et al. Matrix degradability controls multicellularity of 3D cell migration. Nature Communications. 8 (1), 1-8 (2017).
  21. Figueiredo, L., et al. Assessing glucose and oxygen diffusion in hydrogels for the rational design of 3D stem cell scaffolds in regenerative medicine. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (5), 1238-1246 (2018).
  22. Daly, A. C., Riley, L., Segura, T., Burdick, J. A. Hydrogel microparticles for biomedical applications. Nature Reviews Materials. , 1-24 (2019).
  23. Chaudhuri, O., et al. Substrate stress relaxation regulates cell spreading. Nature Communications. 6 (1), 1-7 (2015).
  24. Cai, L., Dewi, R. E., Heilshorn, S. C. Injectable hydrogels with in situ double network formation enhance retention of transplanted stem cells. Advanced Functional Materials. 25 (9), 1344-1351 (2015).
  25. Fisher, S. A., Baker, A. E., Shoichet, M. S. Designing peptide and protein modified hydrogels: selecting the optimal conjugation strategy. Journal of the American Chemical Society. 139 (22), 7416-7427 (2017).
  26. Li, R. H., Altreuter, D. H., Gentile, F. T. Transport characterization of hydrogel matrices for cell encapsulation. Biotechnology and Bioengineering. 50 (4), 365-373 (1996).
  27. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6 (6295), (2015).
  28. Grosskopf, A. K., et al. Injectable supramolecular polymer-nanoparticle hydrogels enhance human mesenchymal stem cell delivery. Bioengineering and Translational Medicine. 5 (1), 10147 (2020).
  29. Lopez Hernandez, H., Grosskopf, A. K., Stapleton, L. M., Agmon, G., Appel, E. A. Non-newtonian polymer-nanoparticle hydrogels enhance cell viability during injection. Macromolecular Bioscience. 19 (1), (2019).
  30. Stapleton, L. M., et al. Use of a supramolecular polymeric hydrogel as an effective post-operative pericardial adhesion barrier. Nature Biomedical Engineering. 3 (8), 611-620 (2019).
  31. Roth, G. A., et al. Injectable hydrogels for sustained codelivery of subunit vaccines enhance humoral immunity. ACS Central Science. , (2020).
  32. Steele, A. N., et al. A biocompatible therapeutic catheter-deliverable hydrogel for in situ tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), 1801147 (2019).
  33. Fenton, O. S., et al. Injectable polymer-nanoparticle hydrogels for local immune cell recruitment. Biomacromolecules. 20 (12), 4430-4436 (2019).
  34. Yu, A. C., Smith, A. A., Appel, E. A. Structural considerations for physical hydrogels based on polymer-nanoparticle interactions. Molecular Systems Design & Engineering. 5 (1), 401-407 (2020).
  35. Wisdom, K., Chaudhuri, O. 3D Cell Culture: Methods and Protocols. Koledova, Z. , Springer. New York. 29-37 (2017).
  36. Lohmeijer, B. G., et al. Guanidine and amidine organocatalysts for ring-opening polymerization of cyclic esters. Macromolecules. 39 (25), 8574-8583 (2006).
  37. Cheng, J., et al. Formulation of functionalized PLGA-PEG nanoparticles for in vivo targeted drug delivery. Biomaterials. 28 (5), 869-876 (2007).
  38. Meis, C. M., et al. Self-assembled, dilution-responsive hydrogels for enhanced thermal stability of insulin biopharmaceuticals. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2020).
  39. Franck, A., Germany, T. Viscoelasticity and dynamic mechanical testing. TA Instruments. , New Castle, DE, USA. AN004 (1993).
  40. Appel, E. A., et al. Self-assembled hydrogels utilizing polymer-nanoparticle interactions. Nature Communications. 6, 6295 (2015).
  41. Gallastegui, A., et al. Controlled release of antibiotics from photopolymerized hydrogels: kinetics and microbiological studies. Materials Science and Engineering: C. 102, 896-905 (2019).
  42. Qiao, M., Chen, D., Ma, X., Liu, Y. Injectable biodegradable temperature-responsive PLGA-PEG-PLGA copolymers: synthesis and effect of copolymer composition on the drug release from the copolymer-based hydrogels. International Journal of Pharmaceutics. 294 (1-2), 103-112 (2005).
  43. Schlein, M. Insulin Formulation Characterization-The Thioflavin T Assays. The AAPS Journal. 19 (2), 397-408 (2017).
  44. Preibisch, S., Saalfeld, S., Tomancak, P. Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics. 25 (11), 1463-1465 (2009).
  45. Sakas, G., Grimm, M., Savopoulos, A. EUROGRAPHICS workshop on Rendering Techniques. , Springer. 51-63 (1995).
  46. Axpe, E., et al. A multiscale model for solute diffusion in hydrogels. Macromolecules. 52 (18), 6889-6897 (2019).
  47. Peppas, N., Bures, P., Leobandung, W., Ichikawa, H. Hydrogels in pharmaceutical formulations. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 50 (1), 27-46 (2000).
  48. Ritger, P. L., Peppas, N. A. A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs. Journal of Controlled Release. 5 (1), 23-36 (1987).
  49. Reinhart, C. T., Peppas, N. A. Solute diffusion in swollen membranes. Part II. Influence of crosslinking on diffusive properties. Journal of Membrane Science. 18, 227-239 (1984).
  50. Salinas, C. N., Anseth, K. S. The influence of the RGD peptide motif and its contextual presentation in PEG gels on human mesenchymal stem cell viability. Journal of Tissue Engineering and Regenerative. 2 (5), 296-304 (2008).
  51. Smith, A. A., et al. Nanoparticles presenting potent TLR7/8 agonists enhance anti-PD-L1 immunotherapy in cancer treatment. Biomacromolecules. 21 (9), 3704-3712 (2020).

Tags

הנדסה ביולוגית גיליון 168 אספקת תרופות אנקפסולציה של תאים ביו-חומרים הידרוג'לים ביופארמה
הידרוג'ל פולימר-ננו-חלקיקי להזרקה עבור יישומי אספקת תאים ותרופות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Meis, C. M., Grosskopf, A. K.,… More

Meis, C. M., Grosskopf, A. K., Correa, S., Appel, E. A. Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications. J. Vis. Exp. (168), e62234, doi:10.3791/62234 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter