该协议描述了在聚焦超声和微气泡治疗期间能够对啮齿动物大脑进行实时 体内 多光子荧光成像的外科和技术程序,以增加血脑屏障通透性。
血脑屏障(BBB)是成功将药物输送到大脑的关键挑战。在微气泡存在下进行超声暴露已成为一种有效的方法,可以短暂和局部地增加BBB的通透性,促进药物通过BBB的细胞旁和转运。在超声微气泡治疗期间对脉管系统进行成像将为大脑中超声微气泡治疗的机制和动力学提供有价值和新颖的见解。
在这里,我们提出了一种使用与环形换能器和20倍物镜对齐的颅窗进行活体内多光子显微镜检查的实验程序。这种设置可以在超声微气泡治疗期间对大脑进行高空间和时间分辨率成像。通过开放的颅骨颅窗获得对大脑的光学访问。简而言之,取出一块直径为3-4毫米的颅骨,并用玻璃盖玻片密封大脑的暴露区域。一个0.82 MHz环形传感器安装在顶部,该传感器连接到第二个玻璃盖玻片上。琼脂糖(1%w / v)用于换能器的盖玻片和覆盖颅窗的盖玻片之间,以防止气泡阻碍超声传播。当采取无菌手术程序和抗炎措施时,可以在几周内反复进行超声微泡治疗和成像会议。静脉注射荧光葡聚糖偶联物以可视化脉管系统并量化超声微气泡诱导的影响(例如,渗漏动力学、血管变化)。本文介绍了颅窗放置、环形换能器放置、成像程序、常见故障排除步骤以及该方法的优点和局限性。
治疗神经系统疾病的一个关键挑战是血脑屏障(BBB)的存在。BBB限制亲水性,带电性,极性和大(>400 Da)分子进入脑实质1。目前用于将治疗药物通过BBB输送到脑实质的一种方法是使用立体定向颅内注射2。其他正在研究的侵入性较小的方法受到所用技术复杂性的阻碍,例如设计用于通过BBB3的受体介导递送的药物,或者在靶向区域的空间精度方面受到限制,例如鼻内注射4 或给予高渗溶液5。
超声与全身注射的微气泡(一种超声造影剂)结合使用已被开发为一种无创手段,可以短暂地增加BBB6的通透性。通过使用聚焦换能器7或可操纵的换能器相控阵8,9,超声可以以毫米级精度靶向大脑中的选定区域,从而最大限度地减少脱靶效应。超声微泡治疗可以通过使用磁共振成像引导7,10,11,12,13,14或立体定向框架15来定制每个受试者的大脑解剖结构。此外,通过监测微气泡的声发射,可以实时控制BBB渗透率的增加程度16,17,18。目前正在全球范围内进行临床试验,研究超声微气泡治疗的安全性和可行性(例如,ClinicalTrials.gov 标识符NCT04118764)。
超声微气泡 BBB 治疗通常通过确认治疗诱导的 BBB 通透性增加、在造影剂增强磁共振成像中可视化,或通过体内成像或离体组织学中的染料外渗来评估。然而,大多数显微镜分析是在超声微气泡处理完成后在体外进行的11,19,从而错过了超声暴露期间和之后的动态生物反应。在超声暴露期间进行的实时成像可能有助于了解驱动超声微气泡BBB治疗以及下游反应的机制,这可能会增加我们对其治疗应用的理解。此外,使用具有体内成像技术的慢性颅窗将使纵向研究能够评估超声微气泡治疗的时间方面。
该协议的目标是描述对啮齿动物的急性和慢性研究进行超声微泡治疗的实时多光子成像所需的外科和技术程序(图1)。这分两部分实现:首先,创建颅窗以实现体内成像,其次,在顶部安装环形换能器以实现并行超声处理和成像。颅窗已被神经科学家广泛用于神经血管偶联20、β淀粉样蛋白发病机制21和神经免疫学22等的体内成像。在该协议中,描述了在小鼠和大鼠颅骨中产生急性(非恢复)和慢性(恢复)颅窗的外科手术。颅窗方法,特别是用于慢性实验的方法,已经得到了充分的记录23,24,25。为了与现有文献保持一致,术语”急性”和”慢性”将在整个协议中使用。用于体内成像的环形传感器的设计也已在前面进行了描述26。尽管这些技术的可用性以及从超声微气泡治疗的实时成像中获得的见解,但很少有研究实验室使用这种技术成功发表文献26,27,28,29,30,31,32.因此,在该协议中,描述了进行这些实时超声微气泡实验的手术和技术细节。虽然指定的超声处理和成像参数已针对BBB实验进行了优化,但也可以使用该技术研究超声暴露于大脑的其他影响,例如神经调节33,34,β淀粉样蛋白斑块监测31和免疫细胞反应32。
活体多光子显微镜监测大脑是研究超声暴露期间大脑反应的宝贵工具。据我们所知,这里描述的方案是在超声微气泡治疗期间对脑实质进行多光子显微镜成像的唯一方法。颅窗的创建和环形换能器的使用允许以高空间和时间分辨率实时监测血管,细胞和其他下游对超声微气泡治疗的反应。其他小组在超声微气泡治疗完成后进行了多光子显微镜成像,从而错过了脑实质对治疗的实时反应19。所描述的程序提供了改进的时间控制,允许收集可能有助于阐明超声微气泡治疗背后的急性机制的数据。可以从采集的图像堆栈中提取和分析定量和定性数据,例如外渗动力学27,29,30,β淀粉样蛋白斑块体积的变化31和细胞动力学32。
在整个协议中突出显示了几个故障排除步骤。首先,强调了特别容易出现操作失误的手术步骤,例如在颅窗手术期间使用琼脂糖和放置换能器。还提供了预防动物不适和死亡的步骤,包括在手术期间监测动物生理学,并在注射前彻底涡旋葡聚糖。其次,还强调了换能器的物理规格,以及物镜,换能器和颅窗的对准。环形换能器的规格及其声学特性必须根据所使用的物镜和动物模型来确定。具体而言,环形换能器的内径必须足够大以包围物镜,但又必须足够小,以便牢固地安装在动物的头骨上。此外,换能器的焦点区域必须与所用物镜的范围一致。
一个常见的挑战是颅窗和环形换能器相对于物镜的角度。物镜与颅窗和换能器的正确对中(XY)和对准(Z)可确保换能器的焦点区域以及治疗脑组织的区域与成像视野对齐,并降低成像过程中物镜和换能器之间碰撞的风险。通过调整动物的头部位置和/或旋转固定动物的立体定向框架,可以实现对齐。
应根据研究目的选择显微镜组件(例如,探测器、分束器)和图像采集参数。在这里,由于存在位于物镜和大脑之间的盖玻片和环形换能器,因此使用了长焦距(>2 mm)的物镜。还建议使用正置显微镜,因为它可以留出更多的空间来操纵动物,特别是对于大脑实验。为了捕获超声微气泡引起的血管内染料泄漏的动力学,有利于高时间分辨率,这可以通过使用共振扫描系统来实现。将其与高灵敏度检测系统(如砷化镓磷化物(GaAsP)探测器)相结合,也将获得更有利的图像。
所提出的实验过程有几个局限性。首先,外科手术是相当侵入性的,并且据报道会引起炎症45,尽管炎症可以最小化46。此外,经颅窗手术诱导的免疫反应在手术后2-4周消退23,24,25。此外,钻孔过程,特别是当以过大的力或速度进行时,由于产生的热量,振动和施加的压力,可能会对下层组织造成损害。颅窗手术和多光子成像也被观察到会影响脑温47。通过精心创建原始的颅窗,适当恢复具有慢性颅窗的动物以及使用具有反馈控制的加热源维持正常体温,可以在一定程度上减少这些限制。其次,成像深度受所用显微镜和物镜的限制。例如,如果没有更多的侵入性措施,例如去除覆盖的皮质组织48,或者结合使用微透镜与皮质渗透49,就无法研究超声微气泡治疗在更深部大脑结构(如海马体)中的效果。使用工作距离较长的物镜可以在一定程度上解决此问题,但光穿透在更深处也受到限制。
虽然该协议的代表性图像是从野生型啮齿动物获得的,但所提出的实验程序也可以应用于转基因动物和疾病模型,例如阿尔茨海默病31。与BBB调节无关的超声实验,例如超声诱导的神经调节,也可以使用该协议进行监测33,34。其他可能的应用可以通过使用不同的显微镜或探测器设置来实现,例如将共聚焦显微镜与超高速相机配对50。虽然由于激发体积大,共聚焦显微镜中的光漂白和光毒性相对较差,但超高速成像可以以高时间分辨率可视化脑毛细血管内皮细胞 – 微气泡相互作用,这可以进一步阐明驱动超声 – 微气泡BBB治疗的机制。总而言之,所描述的方案提供了一种实时监测超声微泡BBB实验诱导的血管和细胞效应的方法,提供了一种工具来进一步确定驱动这些治疗的机制,以及阐明脑实质对超声微气泡治疗的下游反应。
The authors have nothing to disclose.
动物的住房由比较医学核心设施(CoMed,NTNU)提供。图 3 是在 BioRender.com 中创建的。视频录制和编辑由NTNU自然科学学院的网站管理员Per Henning完成。该项目由挪威科技大学(挪威特隆赫姆NTNU),挪威研究委员会(RCN 262228),加拿大卫生研究院(FDN 154272),国家卫生研究院(R01 EB003268)和Sunnybrook健康科学中心聚焦超声研究的Temerty主席资助。
Ring transducer placement | |||
Agarose (powder) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Beaker or Erlenmeyer flask (50 ml) | VWR | 213-0462 or 214-1130 | |
Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1363589 | |
Glass coverslips (13 mm) | Thermo Fisher Scientific | CB00130RA120MNT0 | Coverslip for ring transducer. |
Hot plate or microwave | Corning | PC-400D | To heat agarose solution. |
PBS (1X) | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Ring transducer | Custom-made | Custom-made | Custom-made. E.g. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518 |
Rubber stopper | VWR | 217-0867 | |
Animal preparation and drugs | |||
Bupivacaine*A | Aspen | 169912 | Dose: 1 mg/kg, s.c., local anesthetic injected at incision site. |
Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose mouse: 0.05-0.1 mg/kg, s.c., opioid, administer pre-surgery. |
Buprenorphine*A | Indivior | 521634 | Dose rat: 0.01-0.05 mg/kg, s.c.. |
Carprofen*C | Pfizer | DIN 02255693 | Dose: 5 mg/kg, s.c., NSAID, adminster post-surgery. |
Depilatory cream | Veet | N/A | For complete fur removal after trimming. |
Dexamethasone*C | Sandoz | DIN 00664227, 2301 | Dose: 3 mg/kg, i.m., corticosteroid, reduces cerebral edema, administer pre-surgery. |
Enrofloxacin*C | Bayer | DIN: 02249243 | Dose: 5 mg/kg, i.p., antibiotic, administer post-surgery. |
Fur clippers | Aesculap | 90200714 | Exacta/Isis. |
Heating pad | Physitemp Instruments INC | HP-1M | |
Isoflurane | Baxter | ESDG9623C | Dose: 3% induction, 1% maintenance; anesthetic. |
Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose mouse: 2-3 mg/kg, s.c., NSAID, administer pre-surgery. |
Meloxicam*A | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 25388 | Dose rat: 1 mg/kg, s.c. |
Pulse oximeter | STARR Life Sciences Corp | N/A | MouseOx. |
Stereotaxic frame | Kopf | Kopf 900 | |
Sterile ophthalmic ointment | Théa | 597562 | Viscotears. |
Tail vein catheter (24 G) | BD Neoflon | 391350 | |
* Discuss dosing and type of administration with veterinarian prior to use. A For acute window surgeries, C For chronic window surgeries. Dose for mice and rats are the same unless otherwise specified. | |||
Material and equipment for cranial window placement | |||
Alcohol swabs | BD | 326895 | |
Curved fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14002-12 | |
Cotton or fibreless swabs | Chemtronics | CX50 | |
Cyanoacrylate glue (gel) | Loctite | 1594457 (gel), 230992 (liquid) | If unavailable, liquid cyanoacrylate glue can be mixed with extra-fine acrylate powder. |
Dental cement | Lang Dental | Jet Set-4 Denture Repair Package | |
Dental micromotor hand drill | FOREDOM | K.1070-2 | High speed rotary micromotor kit with 2.35 mm collet. |
Forceps | Fine Science Tools | 11152-10, 11370-40 | |
Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00050RA120MNT0 (5 mm) | Mouse cranial windows. |
Glass coverslips | Thermo Fisher Scientific | CB00080RA120MNT0 (8 mm) | Rat cranial windows. |
Micro drill burrs (0.5 mm) | Meisinger | HM71005 (0.5 mm) | |
Micro drill burrs (0.7 mm) | Meisinger | HM71007 (0.7 mm) | |
Stereo microscope | Nikon | SMZ645 | |
Surgical gelatin sponge | Ethicon | MS0005 | |
Vetbond Tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
Weigh boats / trays | VWR | 10803-148 | |
* Autoclave drapes, tools, materials, and gowns, and use sterile surgical gloves, for chronic cranial window surgeries. | |||
Multiphoton microscopy | |||
20x water immersion objective | Olympus | XLUMPLFLN20 XW | Numerical aperture 1.0, working distance 2.0 mm. |
Fluorescent dextran (e.g. FITC 70 kDa) | Sigma Aldrich | 46945 | Recommended 10 kDa-2 MDa. |
MaiTai DeepSee Ti:Sapphire laser oscillator | Spectra-Physics | N/A | |
SliceScope microscope | Scientifica | N/A | |
Ultrasound treatment | |||
50 dB RF Amplifier | E&I | 2100L | |
Matching circuit | Custom-made | Custom-made | Custom-made. |
Microbubbles | Bracco Imaging | N/A | SonoVue (Bracco Imaging, Europe). Dose 1 ml/kg. |
Microbubbles | Lantheus | N/A | Definity (Lantheus Medical Imaging, North America). Dose 0.02-0.04 ml/kg. |
Signal generator | Agilent Technologies | 33500B |