Dit protocol beschrijft het genereren van integratievrije iPSC’s uit foetale weefselfibroblasten door toediening van episomale plasmiden door nucleofection gevolgd door een beschrijving van methoden die worden gebruikt voor iPSC-karakterisering en neuronale differentiatie.
Chromosomale aneuploïden veroorzaken ernstige aangeboren misvormingen, waaronder misvormingen van het centrale zenuwstelsel en foetale sterfte. Prenatale genetische screening is puur diagnostisch en verheldert het ziektemechanisme niet. Hoewel cellen van aneuploïde foetussen waardevol biologisch materiaal zijn met de chromosomale aneuploïdie, zijn deze cellen van korte duur, waardoor hun gebruik voor downstream onderzoeksexperimenten wordt beperkt. Generatie van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) modellen is een effectieve methode van celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van aneuploïde eigenschappen. Ze zijn zelfvernieuwend en differentiëren in gespecialiseerde cellen die doen denken aan de embryonale ontwikkeling. IPSC’s dienen dus als uitstekende hulpmiddelen om vroege ontwikkelingsgebeurtenissen te bestuderen. Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening geassocieerd met een geheel of gedeeltelijk ontbrekend X-chromosoom. Het syndroom wordt gekenmerkt door onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene, metabole, auto-immuun- en cardiovasculaire aandoeningen en neurocognitieve defecten. Het volgende protocol beschrijft isolatie en kweek van fibroblasten uit TS (45XO) foetaal weefsel, generatie van integratievrije TSiPSCs door levering van episomale herprogrammeringsplasmiden door nucleofection gevolgd door karakterisering. De herprogrammering van TSiPSC’s werden aanvankelijk gescreend door levende cel alkalische fosfatasekleuring gevolgd door uitgebreid onderzoek naar pluripotentie biomarkers. Geselecteerde kolonies werden mechanisch ontleed, meerdere keren gepasseerd en stabiele zelfvernieuwende cellen werden gebruikt voor verdere experimenten. De cellen drukten pluripotentietranscriptiefactoren OCT4, NANOG, SOX2, celoppervlakmarkers SSEA 4 en TRA1-81 uit, typisch voor pluripotente stamcellen. Het oorspronkelijke 45XO karyotype bleef na herprogrammering behouden. De TSiPSCs waren in staat om embryoïde lichamen te vormen en te differentiëren in cellen van endoderm, mesoderm en ectoderm die afstammingsspecifieke biomarkers tot expressie brengen ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR HEAVY CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). De exogene episomale plasmiden gingen spontaan verloren en werden na passage 15 in cellen niet gedetecteerd. Deze TSiPSC’s zijn een waardevolle cellulaire bron voor het modelleren van defecte moleculaire en cellulaire neurologische ontwikkeling die neurocognitieve tekorten veroorzaakt die verband houden met het syndroom van Turner.
Aneuploïdieën leiden tot aangeboren afwijkingen/aangeboren misvormingen en zwangerschapsverlies bij de mens. ~50%-70% van de monsters van zwangerschapsverliezen vertonen cytogenetische afwijkingen. Aneuploïde embryo’s die vroeg in de zwangerschap verloren zijn gegaan, kunnen niet gemakkelijk worden verkregen voor experimentele analyse, waardoor de noodzaak ontstaat om andere modellen te ontwikkelen die de menselijke embryogenese nauw weergeven. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) afgeleid van cellen met de diagnose genetische aandoeningen zijn gebruikt om de representatieve genetische onregelmatigheden en hun gevolgen voor de foetale ontwikkeling te modelleren1,2,3,4. Deze iPSC’s lijken op epiblastcellen van het zich ontwikkelende embryo en kunnen de vroege gebeurtenissen van embryovorming samenvatten. Ze maken begrip en karakterisering van het ontwikkelingsprogramma van cellijningen en patronen in vroege zoogdierembryo’s mogelijk. iPSC’s die eerder zijn afgeleid van huidfibroblasten en amniocyten van prenatale diagnostische tests van aneuploïdiesyndromen zoals monosomie X (syndroom van Turner), trisomie 8 (Syndroom van Warkany 2), trisomie 13 (Syndroom van Patau) en partiële trisomie 11; 22 (Emanuel syndroom) hebben waardevolle inzichten opgeleverd met betrekking tot mislukte ontwikkeling4.
Turner syndroom (TS) is een zeldzame aandoening die wordt gekenmerkt door vrouwelijke onvruchtbaarheid, kleine gestalte, endocriene en metabole stoornissen, een verhoogd risico op auto-immuunziekten en een aanleg voor hart- en vaatziekten5. Hoewel het het enige overlevingswaardige monosomiesyndroom is, is het ook dodelijk voor het zich ontwikkelende embryo dat spontane abortussen veroorzaakt6. Overlevende individuen met TS presenteren zich met graden van verandering van X-chromosomaal materiaal in hun cellen. Karyotypen variëren van volledig verlies van één X-chromosoom (45,XO) tot mozaïeken zoals 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, de aanwezigheid van ringchromosomen, de aanwezigheid van Y-chromosomaal materiaal,enz. 5.
Diagnose van het syndroom wordt over het algemeen gedaan door karyotypering van bloed van symptomatische personen en chorion villi sampling (CVS) om vroege aneuploïdie syndromen te detecteren. Aangezien aneuploïdiesyndromen verantwoordelijk zijn voor ~ 30% van de spontane abortussen, is het routine om het product van conceptie (POC) bij een spontane abortus te karyotyperen. Deze foetale cellen, waaronder de chorionvilli die de cytogenetische afwijking bezitten en daarvan afgeleide iPSC’s, bieden een waardevolle bron van biologisch materiaal om aneuploïdiesyndromen te bestuderen4,6. TS iPSC’s zijn eerder vastgesteld uit amniocyten via retrovirale herprogrammering4, fibroblasten van chorionvlokken (verkregen door prenatale diagnose) via retrovirale herprogrammering6, uit mononucleaire bloedcellen7 via sendaivirusherprogrammering en uit huidfibroblasten van TS-individuen via lentivirale herprogrammering4 . Omdat de primaire focus van ons lab is om ontwikkelingsfalen te begrijpen, hebben we TS iPSC’s gegenereerd uit POC, met name de chorionvilli-component van een spontane abortus8. Alle cellen geïsoleerd uit dit foetale weefsel hadden een 45XO karyotype en leverden iPSC’s op met hetzelfde karyotype. Deze iPSC’s zijn uniek omdat ze de eerste zijn die worden gegenereerd uit een geaborteerde foetus en een waardevolle bron bieden om aneuploïdiegerelateerde zwangerschapsfalen te bestuderen. Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie van het genereren van iPSC’s uit deze unieke celbron via episomale herprogrammering.
De vroege methoden van iPSC-generatie gebruikten virale transductie en transposons om de herprogrammeringsfactoren te leveren. Methoden voor het induceren van cellen tot pluripotentie zijn geëvolueerd van het gebruik van integrerende retrovirale vectoren9, excisable lentiviral vectoren10,11 en transposon-gebaseerde methoden12 tot niet-integrerende adenovirale vectoren13 en Sendai virus gebaseerde vectoren14. Retrovirale en lentivirale herprogrammering, hoewel efficiënt, omvat integratie van de herprogrammeringsfactoren in de gastheerchromosomen, waardoor insertiemutaties ontstaan die onvoorziene effecten hebben in de iPSC’s. Bovendien voorkomt virale herprogrammering translationele toepassing van iPSC’s. RNA-gebaseerde systemen15 en directe eiwitafgifte16 zijn onderzocht om de potentiële risico’s in verband met het gebruik van virussen en DNA-transfecties volledig te elimineren. Deze methoden zijn echter inefficiënt gebleken.
In 2011 rapporteerden Okita et al. een verbeterde efficiëntie van herprogrammering door episomale plasmiden aangevuld met TP53-onderdrukking via shRNA. Ze vervingen ook cMYC door niet-transformerende LMYC (kleincellig longcarcinoom geassocieerde MYC) om de veiligheid van de hiPSC’s te verbeteren. Deze episomale plasmiden drukken 5 herprogrammeringsfactoren uit: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC en shRNA voor TP5317,18. Deze vectoren worden extra-chromosomaal gehandhaafd en gaan verloren uit de geherprogrammeerde cellen bij continue kweek, waardoor de lijnen transgeenvrij worden binnen 10-15 passages. Nucleofection is een gespecialiseerde vorm van elektroporatie die nucleïnezuren rechtstreeks in de kern van gastheercellen aflevert. Het is een efficiënte methode voor de toediening van de herprogrammeringsplasmiden in verschillende celtypen. Episomale plasmiden zijn kosteneffectief en compenseren de hoge kosten van nucleofection. Deze methode is efficiënt en reproduceerbaar onder geoptimaliseerde omstandigheden en levert stabiele iPSC’s op uit een verscheidenheid aan somatische cellen. In dit protocol beschrijven we de methode voor het genereren van iPSC’s uit fibroblasten geïsoleerd uit foetaal weefsel door nucleofection van episomale herprogrammeringsplasmiden. Hier zijn de gedetailleerde protocollen voor fibroblastisolatie van foetale chorionvilli, plasmidezuivering, nucleofection, plukken van kolonies uit de herprogrammeringsplaat en vaststelling van stabiele iPSC’s.
Het is essentieel om de aanwezigheid van pluripotentiekenmerken in de nieuw gegenereerde iPSC’s te bevestigen. Dit omvat het aantonen van pluripotentiegerelateerde factoren (bijv. alkalische fosfatase-expressie, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherine; meestal aangetoond met immunofluorescentie- of genexpressietests), identificatie van de drie kiemlagen door in vitro differentiatietests om hun differentiatiepotentiaal te valideren, karyotypering om het chromosomale gehalte te bepalen, STR-typering om identiteit met oudercellen vast te stellen, verlies van exogene genen te verifiëren, en strengere in vivo testen zoals teratoomvorming en tetraploïde complementatie. Hier beschrijven we karakteriseringsprotocollen van karyotypering, alkalische fosfatasekleuring van levende cellen, detectie van pluripotentiegerelateerde biomarkers door immunofluorescentie, in vitro differentiatietests en methode om verlies van exogene genen aan te tonen19.
Het genereren van stabiele cellulaire modellen van cytogenetisch abnormaal foetaal weefsel is noodzakelijk voor het bestendigen van een defect fenotype. De iPSC-route is de meest effectieve methode voor celvoorbereiding voor eeuwigdurend behoud van defecte eigenschappen20.
Pluripotente stamcellen (PSC) vertonen eigenschappen van zelfvernieuwing en differentiatie in gespecialiseerde cellen die doen denken aan vroege splitsingsembryo’s21. Vandaar d…
The authors have nothing to disclose.
Financiële steun voor het bovenstaande onderzoek werd verstrekt door Manipal Academy of Higher Education. De karakterisering van de lijn werd gedeeltelijk uitgevoerd in het laboratorium van M.M. Panicker bij NCBS. Wij danken Anand Diagnostic Laboratory voor hulp bij karyotypering.
0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |