सिंड्रोम से जुड़े न्यूरोलॉजिकल घाटे के डाउनस्ट्रीम मॉडलिंग के लिए टर्नर सिंड्रोम (45XO) भ्रूण कोशिकाओं से प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल की पीढ़ी
Summary
यह प्रोटोकॉल न्यूक्लियोफेक्शन द्वारा एपिसोमल प्लाज्मिड्स के वितरण के माध्यम से भ्रूण ऊतक फाइब्रोब्लास्ट से एकीकरण मुक्त आईपीएससी की पीढ़ी का वर्णन करता है जिसके बाद आईपीएससी लक्षण वर्णन और न्यूरोनल भेदभाव के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों का विवरण होता है।
Abstract
क्रोमोसोमल एन्यूप्लॉइडीज केंद्रीय तंत्रिका तंत्र विकृतियों और भ्रूण की मौत सहित गंभीर जन्मजात विकृतियों का कारण बनता है। प्रसव पूर्व आनुवंशिक स्क्रीनिंग विशुद्ध रूप से नैदानिक है और रोग तंत्र स्पष्ट नहीं करता है । यद्यपि एन्यूप्लाइड भ्रूण से कोशिकाएं क्रोमोसोमल एन्यूप्लाइडी वाले मूल्यवान जैविक सामग्री हैं, इन कोशिकाओं को कम रहता है, जो डाउनस्ट्रीम अनुसंधान प्रयोगों के लिए उनके उपयोग को सीमित करता है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) मॉडल की पीढ़ी एन्यूप्लाइड लक्षणों के सतत संरक्षण के लिए सेल तैयार करने का एक प्रभावी तरीका है। वे आत्म नवीनीकरण कर रहे है और भ्रूण के विकास की याद ताजा विशेष कोशिकाओं में अंतर । इस प्रकार, आईपीएससी प्रारंभिक विकासात्मक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उत्कृष्ट उपकरण के रूप में काम करते हैं। टर्नर सिंड्रोम (टीएस) एक दुर्लभ स्थिति है जो पूरी तरह से या आंशिक रूप से लापता एक्स गुणसूत्र से जुड़ी है। सिंड्रोम बांझपन, छोटे कद, अंतःस्रावी, मेटाबोलिक, ऑटोइम्यून और हृदय विकारों और न्यूरोकॉग्निटिव दोषों की विशेषता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल टीएस (45XO) भ्रूण ऊतक से फाइब्रोब्लास्ट के अलगाव और खेती का वर्णन करता है, लक्षण वर्णन के बाद नाभिक द्वारा एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग प्लाज्मिड्स के वितरण के माध्यम से एकीकरण मुक्त TSiPSCs का उत्पादन। रीप्रोग्रामिंग टीएसआईपीएससी की शुरुआत में लाइव सेल क्षारीय फॉस्फेटस स्टेनिंग द्वारा जांच की गई थी जिसके बाद प्लुरिपोटेंसी बायोमार्कर के लिए व्यापक जांच की गई थी। चयनित उपनिवेशों को यांत्रिक रूप से विच्छेदित किया गया था, कई बार पारित किया गया था और आगे के प्रयोगों के लिए स्थिर आत्म-नवीनीकरण कोशिकाओं का उपयोग किया गया था। कोशिकाओं ने pluripotency प्रतिलेखन कारकों OCT4, NANOG, SOX2, सेल सतह मार्कर SSEA 4 और TRA1-81 pluripotent स्टेम सेल के विशिष्ट व्यक्त किए । मूल 45XO कारियोटाइप को रीप्रोग्रामिंग के बाद बरकरार रखा गया था। TSiPSCs भ्रूण निकायों के रूप में और endoderm, मेसोडर्म और ectoderm वंश विशिष्ट बायोमार्कर ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRICULAR भारी CHAINα/β), (यानीIIII TUBULIN)) व्यक्त की कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम थे । एक्सोजेनस एपिसोमल प्लाज्मिड अनायास खो गए थे और कोशिकाओं में 15 पारित होने के बाद पता नहीं चला। ये TSiPSCs दोषपूर्ण आणविक और सेलुलर न्यूरोडेवलपमेंट मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान सेलुलर संसाधन हैं जो टर्नर सिंड्रोम से जुड़े न्यूरोकॉग्निटिव घाटे के कारण होते हैं।
Introduction
एन्यूप्लाइडीज से मनुष्यों में जन्म दोष/जन्मजात विकृतियां और गर्भावस्था में कमी होती है । ~ 50%-गर्भावस्था के नुकसान से नमूनों का 70% साइटोजनेटिक असामान्यताओं को दर्शाता है। गर्भावस्था में जल्दी खो एन्यूप्लाइड भ्रूण आसानी से प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है अंय मॉडलों को विकसित करने की आवश्यकता को बढ़ाने के बारीकी से मानव भ्रूणजीने की क्षमता का प्रतिनिधित्व । आनुवंशिक विकारों से उत्पन्न कोशिकाओं से प्राप्त प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (आईपीएससी) का उपयोग प्रतिनिधि आनुवंशिक अनियमितताओं और भ्रूण के विकास पर उनके परिणाम को मॉडल करने के लिए किया गया है1,2,3,4. ये आईपीएससी विकासशील भ्रूण की एपिब्लास्ट कोशिकाओं के समान हैं और भ्रूण गठन की प्रारंभिक घटनाओं को फिर से ड्जेनेट कर सकते हैं। वे शुरुआती स्तनधारी भ्रूण में सेल वंश और पैटर्निंग के विकास कार्यक्रम की समझ और लक्षण वर्णन की अनुमति देते हैं। आईपीएससी पहले त्वचा फाइब्रोब्लास्ट और एम्निओसाइट्स से मोनोसोमी एक्स (टर्नर सिंड्रोम), ट्राइसोमी 8 (स्कैंसी सिंड्रोम 2), ट्राइसोमी 13 (पटाउ सिंड्रोम) और आंशिक ट्राइसोमी 11 जैसे एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम के जन्म के पूर्व नैदानिक परीक्षणों से प्राप्त हुआ; 22 (एमानुएल सिंड्रोम) ने विफल विकास के बारे में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है4।
टर्नर सिंड्रोम (टीएस) एक दुर्लभ स्थिति है जो महिला बांझपन, छोटे कद, अंतःस्रावी और मेटाबोलिक विकारों, ऑटोइम्यून रोग का खतरा बढ़ जाती है, और हृदय रोग5के लिए एक गड़बड़ी की विशेषता है। यद्यपि यह एकमात्र जीवित मोनोसोमी सिंड्रोम है , लेकिन यह विकासशील भ्रूण के लिए भी घातक है जिससे सहज गर्भपात होता है6. टीएस के साथ जीवित व्यक्तियों को उनकी कोशिकाओं में एक्स-क्रोमोसोमल सामग्री के परिवर्तन की डिग्री के साथ मौजूद है । कायोटाइप एक एक्स क्रोमोसोम (45,XO) के पूर्ण नुकसान से लेकर 45,XO/46,XX जैसे मोज़ेक तक; 45,XO/47,XXX, रिंग क्रोमोसोम की उपस्थिति, वाई-क्रोमोसोमल सामग्री की उपस्थिति, आदि5।
सिंड्रोम का निदान आम तौर पर रोगसूचक व्यक्तियों और कोरियोनिक विली नमूना (सीवीएस) के रक्त को जल्दी एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम का पता लगाने के लिए किया जाता है। चूंकि एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम सहज गर्भपात के ~ 30% के लिए खाते हैं, इसलिए सहज गर्भपात पर गर्भाधान (पीओसी) के उत्पाद को कैरियोटाइप करना नियमित है। कोरियोनिक विली सहित ये भ्रूण कोशिकाएं साइटोजेनेटिक असामान्यता और उनसे प्राप्त आईपीएससी एन्यूप्लाइडी सिंड्रोम4,6का अध्ययन करने के लिए जैविक सामग्री का एक मूल्यवान स्रोत प्रदान करती हैं । टीएस आईपीएससी को पहले रेट्रोवायरल रिप्रोग्रामिंग4के माध्यम से एम्निओसाइट्स से स्थापित किया गया है, कोरियोनिक विलाली के फाइब्रोब्लास्ट (जन्म के पूर्व निदान के माध्यम से प्राप्त) रेट्रोवायरल रिप्रोग्रामिंग6के माध्यम से, रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से7 सेंडेई वायरस रिप्रोग्रामिंग के माध्यम से और टीएस व्यक्तियों की त्वचा फाइब्रोब्लास्ट से4 . चूंकि हमारी प्रयोगशाला का प्राथमिक ध्यान विकास की विफलता को समझना है, इसलिए हमने पीओसी से टीएस आईपीएससी उत्पन्न किया है, विशेष रूप से एक सहज गर्भपात8का कोरियोनिक विली घटक। इस भ्रूण ऊतक से अलग सभी कोशिकाओं में एक 45XO कारियोटाइप था और एक ही karyotype के साथ आईपीएससी मिले । ये आईपीएससी अद्वितीय हैं क्योंकि वे सबसे पहले गर्भपात किए गए भ्रूण से उत्पन्न होते हैं और एन्यूप्लाइडी संबंधित गर्भावस्था विफलताओं का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करते हैं। यह लेख एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग के माध्यम से इस अद्वितीय सेल स्रोत से आईपीएससी की पीढ़ी की विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है।
आईपीएससी पीढ़ी के शुरुआती तरीकों ने रीप्रोग्रामिंग कारकों को वितरित करने के लिए वायरल ट्रांसडक्शन और ट्रांसपोसंस का उपयोग किया। कोशिकाओं को बहुलता में उत्प्रेरण करने के तरीके रेट्रोवायरल वैक्टर9,उत्तेजनीय लेंटीवायरल वैक्टर10, 11 और ट्रांसपोसन आधारित तरीकों 12 को गैर-एकीकृत करने वाले एडेनोविराल वैक्टर13 और सेंडाइ वायरस आधारित वैक्टर14 का उपयोग करने से विकसित हुए हैं। रेट्रोवायरल और लेंटीवायरल आधारित रीप्रोग्रामिंग, हालांकि कुशल, मेजबान गुणसूत्रों में पुनर्प्रोग्रामिंग कारकों का एकीकरण शामिल है, जिससे सम्मिलन उत्परिवर्तन होते हैं जिनका आईपीएससी में अप्रत्याशित प्रभाव पड़ता है। इसके अलावा, वायरल आधारित पुनर्प्रोग्रामिंग आईपीएससी के अनुवादात्मक अनुप्रयोग को रोकता है। वायरस और डीएनए ट्रांसफेक्शन के इस्तेमाल से जुड़े संभावित जोखिमों को पूरी तरह से खत्म करने के लिए आरएनए बेस्ड सिस्टम15 और डायरेक्ट प्रोटीन डिलिवरी16 का पता लगाया गया है । हालांकि, इन तरीकों अक्षम साबित कर दिया है ।
2011 में, ओकिटा एट अल ने श्र्ना के माध्यम से टीपी 53 दमन के साथ संवर्धित एपिसोमल प्लाज्मिड्स द्वारा पुनर्प्रोग्रामिंग की बेहतर दक्षता की सूचना दी। उन्होंने एचएसएससी की सुरक्षा बढ़ाने के लिए सीएसवाईसी को गैर-ट्रांसफॉर्मिंग एलएमवाईसी (स्मॉल सेल लंग कार्सिनोमा एसोसिएटेड MYC) के साथ भी बदल दिया । ये एपिसोमल प्लाज्मिड्स 5 रीप्रोग्रामिंग कारक व्यक्त करते हैं: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC और TP5317,18के लिए shRNA । इन वैक्टरों को अतिरिक्त गुणसूत्रों को बनाए रखा जाता है और निरंतर संस्कृति पर पुनर्प्रोग्राम्ड कोशिकाओं से खो दिया जाता है, इस प्रकार 10-15 मार्गों के भीतर लाइनों को ट्रांसजेन-मुक्त बना दिया जाता है। न्यूक्लियोफेक्शन इलेक्ट्रोपॉनेशन का एक विशेष रूप है जो सीधे मेजबान कोशिकाओं के नाभिक में न्यूक्लिक एसिड बचाता है। यह विभिन्न सेल प्रकारों में पुनर्प्रोग्रामिंग प्लाज्मिड के वितरण के लिए एक कुशल विधि है। एपिसोमल प्लाज्मिड लागत प्रभावी होते हैं और नाभिक की उच्च लागत की भरपाई करते हैं। यह विधि विभिन्न प्रकार की दैहिक कोशिकाओं से स्थिर आईपीएससी उपज अनुकूलित स्थितियों के तहत कुशल और प्रजनन योग्य है। इस प्रोटोकॉल में, हम एपिसोमल रिप्रोग्रामिंग प्लाज्मिड के नाभिक द्वारा भ्रूण ऊतक से अलग फाइब्रोब्लास्ट से आईपीएससी के उत्पादन के लिए विधि का वर्णन करते हैं। यहां भ्रूण कोरियोनिक विली, प्लाज्मिड शुद्धिकरण, न्यूक्लियोफेक्शन, पुनर्प्रोग्रामिंग प्लेट से उपनिवेशों को चुनने और स्थिर आईपीएससी की स्थापना से फाइब्रोब्लास्ट अलगाव के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल दिए गए हैं।
नए उत्पन्न आईपीएससी में pluripotency लक्षणों की उपस्थिति की पुष्टि करना आवश्यक है। इसमें पूर्णाधिकारी से संबंधित कारकों का प्रदर्शन शामिल है (उदाहरण के लिए, क्षारीय फॉस्फेट अभिव्यक्ति, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, ई-cadherin; आमतौर पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस या जीन अभिव्यक्ति परख के साथ दिखाया गया है), विट्रो भेदभाव में द्वारा तीन रोगाणु परतों की पहचान उनके भेदभाव क्षमता को मान्य करने के लिए, क्रोमोसोमल सामग्री निर्धारित करने के लिए karyotyping, माता-पिता की कोशिकाओं के साथ पहचान स्थापित करने के लिए स्ट्रक्य टाइपिंग, और वीवो में अधिक कठोर जैसे टेराटोमा गठन और टेट्राप्लॉयड पूरक। यहां हम कायोटाइपिंग के लक्षण वर्णन प्रोटोकॉल, जीवित कोशिकाओं क्षारीय फॉस्फेट धुंधला, इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा प्लूपपोती से संबंधित बायोमार्कर का पता लगाने, इन विट्रो भेदभाव परख और एक्सोजेनस जीन19के नुकसान को प्रदर्शित करने की विधि का वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
दोषपूर्ण फेनोटाइप को बनाए रखने के लिए साइटोननिक असामान्य भ्रूण ऊतक के स्थिर सेलुलर मॉडल का उत्पादन आवश्यक है। आईपीएससी मार्ग दोषपूर्ण गुणों के सतत संरक्षण के लिए सेल तैयार करने का सबसे प्रभावी<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
उपर्युक्त शोध के लिए वित्तीय सहायता मणिपाल उच्च शिक्षा अकादमी द्वारा प्रदान की गई थी। एनसीबीएस में एम.M एंक्टर की प्रयोगशाला में आंशिक रूप से लाइन का लक्षण वर्णन किया गया था। हम करयोटाइपिंग के साथ सहायता के लिए आनंद डायग्नोस्टिक लेबोरेटरी को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
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