ターナー症候群(45XO)の胎児細胞による、その症候群に伴う神経障害の下流モデリングのための人工多能性幹細胞の生成
Summary
このプロトコルは、核軟部によるエピソームプラスミドの送達を通じた胎児組織線維芽細胞からの統合自由なiPSCの生成と、iPSC特性評価および神経分化に用いられる方法の記述を記述する。
Abstract
染色体の無数化は、中枢神経系奇形や胎児死を含む重度の先天性奇形を引き起こす。出生前の遺伝子スクリーニングは純粋に診断であり、疾患メカニズムを解明するものではありません。無数性胎児の細胞は染色体異数化を有する貴重な生物学的物質であるが、これらの細胞は短命であり、下流の研究実験への使用を制限している。誘導多能性幹細胞(iPSC)モデルの生成は、無数形質の永久保存のための細胞調製の有効な方法である。彼らは自己更新し、胚発生を連想させる特殊な細胞に分化しています。したがって、iPSCは初期の発生事象を研究するための優れたツールとして機能します。ターナー症候群(TS)は、完全にまたは部分的に欠けているX染色体に関連する稀な状態である。この症候群は、不妊症、低身長、内分泌、代謝、自己免疫障害および心血管障害および神経認知障害を特徴とする。以下のプロトコルは、TS(45XO)胎児組織からの線維芽細胞の単離および培養、核整形によるエピソームリプログラミングプラスミドの送達を介した統合自由TSiPSCの生成、その後の特徴付けについて説明する。TSiPSCのリプログラミングは、最初は生細胞アルカリホスファターゼ染色によってスクリーニングされ、続いて多能性バイオマーカーの広範な調査が行われました。選択したコロニーを機械的に解剖し、数回通過し、安定した自己更新細胞を更なる実験に使用した。細胞は、多能性転写因子OCT4、NANOG、SOX2、細胞表面マーカーSSEA 4およびTRA1-81の多能性幹細胞の典型的な転写因子を発現した。元の45XOの核型はポストリプログラミングを保持していた。TSiPSCは胚体を形成し、系統特異的バイオマーカー((SRY BOX17)(ミオシンヴェントリーキュラーヘビーチャイエンα/β)(βIII TUBULIN)を発現する内胚体、中胚および外胚の細胞に分化することができた。外因性エピソームプラスミドは、細胞内で15を通過した後、自発的に失われ、検出されなかった。これらのTSiPSCは、ターナー症候群に関連する神経認知障害を引き起こす欠陥のある分子および細胞性神経発達をモデル化するための貴重な細胞資源である。
Introduction
無数化は、出生時欠損/先天性奇形およびヒトにおける妊娠喪失を引き起こす。妊娠喪失から50%~70%の検体が細胞遺伝学的異常を示す。妊娠初期に失われた無数胚は、ヒト胚発生を密接に表す他のモデルを開発する必要性を高める実験分析では容易には得られない。遺伝性疾患と診断された細胞由来の誘導多能性幹細胞(iPSC)は、胎児の発達における代表的な遺伝的不規則性とその結果をモデル化するために用いられてきた。これらのiPSCは、現像性胚のエピブラスト細胞に似ており、胚形成の初期の事象を再現することができる。これらは、初期の哺乳類胚における細胞系統およびパターニングの発達プログラムの理解と特徴付けを可能にする。iPSCは、単一体性X(ターナー症候群)、トリソミー8(ワルカニー症候群2)、トリソミー13(パタウ症候群)および部分トリソミー11のような無数数分解症候群の出生前診断試験から以前に由来する皮膚線維芽細胞およびアミオサイトから誘導された。22(エマニュエル症候群)は、失敗した開発4に関する貴重な洞察を提供しています。
ターナー症候群(TS)は、女性の不妊、低身長、内分泌および代謝障害、自己免疫疾患のリスクの増加、および心血管疾患に対する素因を特徴とする稀な状態である5。それは唯一の生存可能な単一体症候群であるが、それはまた、自発的な中絶を引き起こす発達中の胚に致命的である6.TSを有する生存者は、細胞内のX染色体物質の変化の程度を有する。核型は、1つのX染色体(45,XO)の完全な損失から45、XO / 46、XXのようなモザイクまで及ぶ。45、XO/47、XXX、環染色体の存在、Y染色体物質の存在、5.
この症候群の診断は、一般的に、症状のある個人の核型血液と、初期の異性数体症候群を検出するための絨毛絨毛サンプリング(CVS)によって行われる。無数性症候群は、自然流産の30%を占めるので、自然流産時に受胎(POC)の産物を核型化することは日常的である。これらの胎児細胞は、細胞遺伝学的異常を有する絨毛性絨毛およびそれらに由来するiPSCを含む、無数性症候群4,6を研究するための有用な生物材料源を提供する。TS iPSCは、レトロウイルスリプログラミング4を介してアニオサイトから以前に確立されており、レトロウイルスリプログラミング6を介して絨毛性絨毛絨毛菌の線維芽細胞(出生前診断を通じて得られる)、センダイウイルスリプログラミングを介した血液単核細胞7から、およびレンチウイルスリプログラミングを介したTS個体の皮膚線維芽細胞から4.私たちの研究室の主な焦点は発達障害を理解することなので、私たちはPOCからTS iPSC、特に自発的中絶の絨毛絨毛性絨毛成分を生成しました 8.この胎児組織から単離された細胞は全て45XOの核型を有し、同じ核型のiPSCを生み出した。これらのiPSCは、中絶された胎児から最初に生成され、妊娠障害に関連する妊娠障害を研究するための貴重なリソースを提供するので、ユニークです。この記事では、エピソームリプログラミングを通じて、このユニークな細胞源からのiPSCの生成の詳細な方法論を提供します。
iPSC生成の初期の方法では、ウイルス伝達とトランスポゾンを使用してリプログラミング因子を提供しました。細胞を多能性に誘導する方法は、レトロウイルスベクター9、切除可能なレンチウイルスベクター10、11およびトランスポゾンベースの方法12を用い、非統合型アデノウイルスベクター13およびセンダイウイルスベースベクター14に進化した。レトロウイルスおよびレンチウイルスベースのリプログラミングは、効率的ではあるが、宿主染色体へのリプログラミング因子の統合を伴い、iPSCに予期せぬ影響を及ぼす挿入突然変異を引き起こす。さらに、ウイルスベースのリプログラミングは、iPSCの翻訳適用を防ぎます。RNA系システム15および直接タンパク質送達16は、ウイルスおよびDNAトランスフェクションの使用に関連する潜在的なリスクを完全に排除するために検討されている。しかし、これらの方法は非効率的であることが証明されています。
2011年、沖田らは、shRNAを介したTP53抑制によって増強されたエピソームプラスミドによるリプログラミングの効率向上を報告した。彼らはまた、cMYCを非変形型LMYC(小細胞肺癌関連MYC)に置き換え、hipscの安全性を高めました。これらのエピソームプラスミドは、5つのリプログラミング因子を発現する:OCT4、LIN28、SOX2、KLF4、LMYCおよびSHRNA用TP5317,18。これらのベクターは、余分な染色体的に維持され、連続培養時に再プログラムされた細胞から失われ、10〜15の通過以内にラインをトランスジーンフリーにします。核細胞は、宿主細胞の核に直接核酸を送達するエレクトロポレーションの特殊な形態です。これは、様々な細胞タイプにリプログラミングプラスミドを送達するための効率的な方法です。上皮プラスミドは費用効果が高く、核の高い費用を補います。この方法は、様々な体細胞から安定したiPSCを生み出す最適化された条件下で効率的かつ再現可能です。本プロトコルでは、エピソームリプログラミングプラスミドの核形成によって胎児組織から単離された線維芽細胞からのiPSCの生成方法について述べている。ここでは、胎児絨毛絨毛絨毛、プラスミド精製、核整離、リプログラミングプレートからのコロニーの摘出、安定したiPSCの確立からの線維芽細胞の分離のための詳細なプロトコルを示します。
新たに生成されたiPSCにおける多能性特性の存在を確認することが不可欠である。これには、多能性関連因子のデモンストレーションが含まれます(例えば、 アルカリホスファターゼ発現、ナノグ、SSEA4、Tra 1-80、Tra 1-81、E-カドヘリン;通常、免疫蛍光または遺伝子発現アッセイで示される)、インビトロ分化アッセイによる3つの胚芽層の同定、染色体含有量を決定するための核型入力、染色体含有量を決定するためのカルギタイピング、同定を確立するためのSTRタイピング そして、テラトーマ形成および四数相補解のようなインビボアッセイでより厳しい。ここでは、核型の特徴付けプロトコル、生細胞アルカリホスファターゼ染色、免疫蛍光による多能性関連バイオマーカーの検出、外因性遺伝子19の喪失を実証する体外分化アッセイおよび方法について説明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
細胞遺伝学的に異常な胎児組織の安定した細胞モデルの生成は、欠陥表現型を永続させるために必要である。iPSC経路は、欠陥物20の永久保存のための細胞調製の最も効果的な方法である。
多能性幹細胞(PSC)は、初期の切断胚21を連想させる特殊な細胞への自己複製および分化の特性を示す。したがって、PSCは、早期に中絶された胎児の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
上記の研究のための財政支援は、高等教育のマニパルアカデミーによって提供されました.ラインの特徴付けは、NCBSのM.Mパニッカーの研究室で部分的に行われました。アナンド診断研究所のカリョタイピングに関する支援に感謝します。
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
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