Генерация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фетальных клеток синдрома Тернера (45XO) для последующего моделирования неврологического дефицита, связанного с синдромом
Summary
Этот протокол описывает генерацию свободных от интеграции ИПСК из фибробластов тканей плода путем доставки эписомальных плазмид путем нуклеофекции с последующим описанием методов, используемых для характеристики iPSC и дифференцировки нейронов.
Abstract
Хромосомные анеуплоидии вызывают тяжелые врожденные пороки развития, включая пороки развития центральной нервной системы и гибель плода. Пренатальный генетический скрининг является чисто диагностическим и не проясняет механизм заболевания. Хотя клетки анеуплоидных плодов являются ценным биологическим материалом, несущим хромосомную анеуплоидию, эти клетки недолговечны, что ограничивает их использование для последующих исследовательских экспериментов. Генерация моделей индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) является эффективным методом подготовки клеток к постоянному сохранению анеуплоидных признаков. Они самообновляются и дифференцируются в специализированные клетки, напоминающие эмбриональное развитие. Таким образом, ИПСК служат отличными инструментами для изучения событий раннего развития. Синдром Тернера (TS) является редким состоянием, связанным с полностью или частично отсутствующей Х-хромосомой. Синдром характеризуется бесплодием, невысоким ростом, эндокринными, метаболическими, аутоиммунными и сердечно-сосудистыми нарушениями и нейрокогнитивными дефектами. Следующий протокол описывает выделение и культивирование фибробластов из ткани плода TS (45XO), генерацию свободных от интеграции TSiPSCs путем доставки эписомальных перепрограммированных плазмид путем нуклеофекции с последующей характеристикой. Перепрограммирование TSiPSCs первоначально было проверено окрашиванием щелочной фосфатазой живых клеток с последующим обширным прощупыванием биомаркеров плюрипотентности. Отобранные колонии механически рассекались, проходили несколько раз и для дальнейших экспериментов использовались устойчивые самообновляющиеся клетки. В клетках экспрессировались факторы транскрипции плюрипотентности OCT4, NANOG, SOX2, маркеры клеточной поверхности SSEA 4 и TRA1-81, характерные для плюрипотентных стволовых клеток. Оригинальный кариотип 45XO был сохранен после перепрограммирования. TSiPSCs смогли сформировать эмбриоидные тела и дифференцироваться в клетки эндодермы, мезодермы и эктодермы, экспрессируя специфические биомаркеры линии ((SRY BOX17), (MYOSIN ЖЕЛУДОЧКОВЫЙ ТЯЖЕЛЫЙ CHAINα/β), (βIII TUBULIN)). Экзогенные эписомальные плазмиды были потеряны спонтанно и не обнаружены после прохождения 15 в клетках. Эти TSiPSCs являются ценным клеточным ресурсом для моделирования дефектного молекулярного и клеточного нервного развития, вызывающего нейрокогнитивный дефицит, связанный с синдромом Тернера.
Introduction
Анеуплоидии приводят к врожденным дефектам / врожденным порокам развития и потере беременности у людей. ~ 50%-70% образцов от потерь беременности показывают цитогенетические аномалии. Анеуплоидные эмбрионы, потерянные на ранних сроках беременности, не могут быть легко получены для экспериментального анализа, что свидетельствует о необходимости разработки других моделей, близко представляющих эмбриогенез человека. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), полученные из клеток с диагнозом генетических нарушений, были использованы для моделирования репрезентативных генетических нарушений и их последствий для развития плода1,2,3,4. Эти ИПСК напоминают клетки эпибластов развивающегося эмбриона и могут рекапитулировать ранние события формирования эмбриона. Они позволяют понять и охарактеризовать программу развития клеточных линий и паттернов у ранних эмбрионов млекопитающих. иПСК, полученные ранее из фибробластов кожи и амниоцитов из пренатальных диагностических тестов синдромов анеуплоидии, таких как моносомия X (синдром Тернера), трисомия 8 (синдром Варкани 2), трисомия 13 (синдром Патау) и частичная трисомия 11; 22 (синдром Эмануэля) предоставили ценную информацию о неудачном развитии4.
Синдром Тернера (ТС) является редким состоянием, характеризующимся женским бесплодием, невысоким ростом, эндокринными и метаболическими нарушениями, повышенным риском аутоиммунных заболеваний и предрасположенностью к сердечно-сосудистым заболеваниям5. Хотя это единственный выживающий синдром моносомии, он также смертелен для развивающегося эмбриона, вызывая самопроизвольный аборт6. Выжившие особи с ТС присутствуют со степенями изменения X-хромосомного материала в своих клетках. Кариотипы варьируются от полной потери одной Х-хромосомы (45,XO) до мозаики, такой как 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, наличие кольцевых хромосом, наличие Y-хромосомного материала и т.д.5.
Диагностика синдрома обычно проводится путем кариотипирования крови симптоматических лиц и забора ворсинок хориона (CVS) для выявления синдромов ранней анеуплоидии. Поскольку синдромы анеуплоидии составляют ~ 30% самопроизвольных абортов, кариотипировать продукт зачатия (POC) при самопроизвольном аборте является обычным делом. Эти клетки плода, включая ворсинки хориона, обладающие цитогенетической аномалией, и полученные из них ИПСК, обеспечивают ценный источник биологического материала для изучения синдромов анеуплоидии4,6. TS iPSCs были ранее установлены из амниоцитов с помощью ретровирусного перепрограммирования4,фибробластов хорионических ворсинок (полученных путем пренатальной диагностики) путем ретровирусного перепрограммирования6,из мононуклеарных клеток крови7 через перепрограммирование вируса Сендай и из фибробластов кожи лиц TS через лентивирусное перепрограммирование4 . Поскольку основной задачей нашей лаборатории является понимание неудач в развитии, мы создали TS iPSC из POC, в частности, компонент ворсинок хориона самопроизвольного аборта8. Все клетки, выделенные из этой ткани плода, имели кариотип 45XO и давали ИПСК с тем же кариотипом. Эти ИПСК уникальны, поскольку они первыми генерируются абортированным плодом и обеспечивают ценный ресурс для изучения сбоев беременности, связанных с анеуплоидией. В этой статье представлена подробная методология генерации ИПСК из этого уникального источника клеток посредством эписомального перепрограммирования.
Ранние методы генерации iPSC использовали вирусную трансдукцию и транспозоны для доставки факторов перепрограммирования. Методы индуцирования клеток к плюрипотентности эволюционировали от использования интегрируемых ретровирусных векторов9,подакцизных лентивирусных векторов10,11 и транспозонных методов12 к неинтеграционируемым аденовирусным векторам13 и векторам на основе вируса Сендай14. Ретровирусное и лентивирусное перепрограммирование, хотя и эффективное, включает интеграцию факторов перепрограммирования в хромосомы хозяина, вызывая мутации вставки, которые имеют непредвиденные эффекты в иПСК. Кроме того, вирусное перепрограммирование предотвращает трансляционный применение иПСК. Системы15 на основе РНК и прямая доставка белка16 были исследованы для полного устранения потенциальных рисков, связанных с использованием вирусов и трансфекций ДНК. Однако эти методы оказались неэффективными.
В 2011 году Okita et al. сообщили об улучшении эффективности перепрограммирования эписомальными плазмидами, дополненными подавлением TP53 через шРНК. Они также заменили cMYC на нетрансформирующий LMYC (МЕЛКОКЛЕТОЧНЫЙ РАК ЛЕГКОГО, ассоциированный MYC) для повышения безопасности hiPSCs. Эти эписомальные плазмиды экспрессуют 5 факторов перепрограммирования: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC и шРНК для TP5317,18. Эти векторы поддерживаются внехромосомно и теряются из перепрограммированных клеток при непрерывной культуре, что делает линии свободными от трансгенов в течение 10-15 проходов. Нуклеофекция представляет собой специализированную форму электропорации, которая доставляет нуклеиновые кислоты непосредственно в ядро клеток-хозяев. Это эффективный метод доставки перепрограммированных плазмид в различные типы клеток. Эписомальные плазмиды экономически эффективны и компенсируют высокие затраты на нуклеофекцию. Этот метод эффективен и воспроизводим в оптимизированных условиях, что дает стабильные ИПСК из различных соматических клеток. В этом протоколе описан способ генерации иПСК из фибробластов, выделенных из ткани плода нуклеофекции эписомальных перепрограммированных плазмид. Вот подробные протоколы выделения фибробластов из ворсин хориона плода, очистки плазмид, нуклеофекции, отбора колоний из перепрограммируемой пластины и установления стабильных иПСК.
Важно подтвердить наличие признаков плюрипотентности во вновь генерируемых иПСК. Это включает в себя демонстрацию факторов, связанных с плюрипотентностью (например, экспрессия щелочной фосфатазы, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-кадгерин; обычно показан с помощью иммунофлуоресценции или анализов экспрессии генов), идентификацию трех зародышевых слоев с помощью анализов дифференцировки in vitro для проверки их потенциалов дифференцировки, кариотипирование для определения хромосомного содержания, типирование STR для установления идентичности с родительскими клетками, проверку потери экзогенных генов, и более строгие анализы in vivo, такие как образование тератомы и тетраплоидная комплементация. Здесь описываются протоколы характеризации кариотипирования, окрашивания щелочной фосфатазы живых клеток, обнаружения связанных с плюрипотентностью биомаркеров иммунофлуоресценцией, анализов дифференцировки in vitro и метода демонстрации потери экзогенных генов19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Генерация стабильных клеточных моделей цитогенетически аномальной ткани плода необходима для увековечения дефектного фенотипа. Путь iPSC является наиболее эффективным методом клеточной подготовки к бессрочному сохранению дефектных свойств20.
Плюрипотентн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовую поддержку вышеуказанному исследованию оказала Академия высшего образования Манипал. Характеристика линии проводилась частично в лаборатории М.M. Паникера в НЦБС. Благодарим Диагностическую лабораторию Ананда за помощь в кариотипии.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
- Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
- Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
- Biancotti, J. -. C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
- Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
- Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
- Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
- Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
- Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).
