Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi
Summary
Bu protokol, epizomal plazmidlerin nükleofeksiyon ile verilmesi yoluyla fetal doku fibroblastlarından entegrasyonsuz iPSC’lerin üretilmesini ve ardından iPSC karakterizasyonu ve nöronal farklılaşma için kullanılan yöntemlerin tanımlanmasını açıklar.
Abstract
Kromozomal aneuploidiler merkezi sinir sistemi malformasyonları ve fetal ölüm de dahil olmak üzere şiddetli konjenital malformasyonlara neden olur. Prenatal genetik tarama tamamen tanısaldır ve hastalık mekanizmasını aydınlatmaz. Aneuploid fetüslerden gelen hücreler kromozomal aneuploidi taşıyan değerli biyolojik malzeme olmasına rağmen, bu hücreler kısa ömürlüdür ve aşağı akış araştırma deneyleri için kullanımlarını sınırlar. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) modellerinin üretilmesi, aneuploid özelliklerinin sürekli korunması için hücre hazırlamanın etkili bir yöntemidir. Embriyonik gelişimi anımsatan özel hücrelere kendi kendini yeniler ve ayırt ederler. Bu nedenle, iPSC’ler erken gelişim olaylarını incelemek için mükemmel araçlar olarak hizmet vermektedir. Turner sendromu (TS), tamamen veya kısmen eksik bir X kromozomu ile ilişkili nadir bir durumdur. Sendrom infertilite, kısa boy, endokrin, metabolik, otoimmün ve kardiyovasküler bozukluklar ve nöroknasitif kusurlar ile karakterizedir. Aşağıdaki protokol, fibroblastların TS (45XO) fetal dokudan izolasyonu ve kültleştirilmesini, epizomal yeniden programlanan plazmidlerin nükleofeksiyon ve ardından niteleme yoluyla entegrasyonsuz TSiPSC’lerin üretilmesini açıklamaktadır. Yeniden programlanan TSiPSC’ler başlangıçta canlı hücre alkali fosfataz boyama ve ardından pluripotency biyobelirteçler için kapsamlı problama ile tarandı. Seçilen koloniler mekanik olarak parçalandı, birkaç kez geçirildi ve daha fazla deney için kararlı kendini yenileyen hücreler kullanıldı. Hücreler pluripotency transkripsiyon faktörlerini ifade etti OCT4, NANOG, SOX2, hücre yüzey belirteçleri SSEA 4 ve TRA1-81 pluripotent kök hücrelere özgüdür. Orijinal 45XO karyotip, yeniden programlama sonrası tutuldu. TSiPSC’ler embriyoid cisimleri oluşturabildi ve endoderm, mezoderm ve ektoderm hücrelerine dönüşerek soyuna özgü biyobelirteçlere ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRIKÜLER AĞIR CHAINα/β), (βIII TUBULIN)) hücrelerine farklılaştı. Eksojen epizomal plazmidler kendiliğinden kaybedildi ve hücrelerde 15. Bu TSiPSC’ler Turner sendromu ile ilişkili nörokingtif açıklara neden olan kusurlu moleküler ve hücresel nörogelişim modellemek için değerli bir hücresel kaynaktır.
Introduction
Aneuploidiler insanlarda doğum kusurlarına/konjenital malformasyonlara ve gebelik kaybına yol açar. Gebelik kayıplarından elde edilen örneklerin ~%50-%70’inde sitogenetik anormallikler görülür. Gebelikte erken kaybedilen aneuploid embriyolar, insan embriyogenezini yakından temsil eden başka modeller geliştirme ihtiyacını artıran deneysel analizler için kolayca elde edilemez. Genetik bozukluk tanısı alan hücrelerden elde edilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler), temsili genetik düzensizliklerive fetal gelişim 1 , 2,3,4üzerindeki sonuçları modellemek için kullanılmıştır. Bu iPSC’ler gelişmekte olan embriyonun epiblast hücrelerine benzer ve embriyo oluşumunun erken olaylarını nüksedebilir. Erken memeli embriyolarında hücre soylarının ve desenlerinin gelişim programının anlaşılmasına ve karakterizasyonuna izin verirler. Daha önce monozomi X (Turner sendromu), trizomi 8 (Warkany sendromu 2), trizomi 13 (Patau sendromu) ve kısmi trizomi 11 gibi aneuploidi sendromlarının prenatal tanı testlerinden cilt fibroblastları ve amniyositlerden elde edilen iPSC’ler; 22 (Emanuel sendromu) başarısız gelişim hakkında değerli içgörüler sağlamıştır4.
Turner sendromu (TS), kadın kısırlığı, kısa boy, endokrin ve metabolik bozukluklar, otoimmün hastalık riskinin artması ve kardiyovasküler hastalığa yatkınlık ile karakterize nadir bir durumdur5. Hayatta kalabilen tek monosomi sendromu olmasına rağmen, spontan kürtajlara neden olan gelişmekte olan embriyo için de ölümcüldür6. TS ile hayatta kalan bireyler hücrelerinde X kromozomal malzemenin değişim dereceleri ile mevcuttur. Karyotipler bir X kromozomunun (45,XO) tamamen kaybolmasından 45,XO/46,XX gibi mozaiklere kadar uzanır; 45,XO/47,XXX, halka kromozomlarının varlığı, Y kromozomal malzemenin varlığı, vb5.
Sendromun tanısı genellikle semptomatik bireylerin kanının karyotipingi ve erken aneuploidi sendromlarını tespit etmek için koryonik villi örnekleme (CVS) ile yapılır. Anöploidi sendromları spontan kürtajların ~%30’unu oluşturduğundan, spontan kürtaj üzerine gebe kalma (POC) ürününü karyotip etmek rutindir. Sitogenetik anormalliğe sahip koryonik villi ve onlardan türetilen iPSC’ler de dahil olmak üzere bu fetal hücreler, aneuploidi sendromlarını incelemek için değerli bir biyolojik malzeme kaynağı sağlar4,6. TS iPSC’ler daha önce retroviral reprogramlama yoluyla amniyositlerden4, koryonik villi fibroblastları (prenatal tanı ile elde edilir) retroviral yoluyla kurulmuştur. reprogramming6, sendai virüs reprogramming yoluyla kan mononükleer hücrelerden7 ve lentiviral yeniden programlama yoluyla TS bireylerin cilt fibroblastları4 . Laboratuvarımızın birincil odağı gelişimsel başarısızlığı anlamak olduğundan, POC’den TS iPSC’leri, özellikle de spontan bir kürtajın koryonik villi bileşenini oluşturduk8. Bu fetal dokudan izole edilen tüm hücrelerin 45XO karyotipi vardı ve aynı karyotipe sahip iPSC’ler verdi. Bu iPSC’ler, kürtaj yapılan bir fetüsten ilk oluşturulanlar olduğu ve aneuploidi ile ilgili gebelik başarısızlıklarını incelemek için değerli bir kaynak sağladıkları için benzersizdir. Bu makalede, epizomal yeniden programlama yoluyla bu benzersiz hücre kaynağından iPSC’lerin neslinin ayrıntılı bir metodolojisi sağlanmıştır.
iPSC neslinin ilk yöntemleri, yeniden programlama faktörlerini sunmak için viral transdüksiyon ve transposonlar kullandı. Hücreleri pluripotency’ye indükleme yöntemleri retroviral vektörler9, uyarılabilir lentiviral vektörler10 , 11ve transposon bazlı yöntemler12’yi entegre etmeyen adenoviral vektörler13 ve Sendai virüs bazlı vektörler14kullanılarak evrimleşmiştir. Retroviral ve lentiviral bazlı yeniden programlama, verimli olmasına rağmen, yeniden programlama faktörlerinin konak kromozomlarına entegrasyonunu içerir ve iPSC’lerde öngörülemeyen etkileri olan ekleme mutasyonlarına neden olur. Ayrıca, viral tabanlı yeniden programlama, iPSC’lerin çevirisel uygulamasını engeller. Virüslerin ve DNA transfeksiyonlarının kullanımıyla ilgili potansiyel riskleri tamamen ortadan kaldırmak için RNA tabanlı sistemler15 ve doğrudan protein iletimi16 araştırılmıştır. Ancak, bu yöntemlerin verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.
2011 yılında Okita ve arkadaşları, shRNA ile TP53 bastırma ile artırılmış epizomal plazmidler tarafından yeniden programlama verimliliğinin arttığını bildirdi. Ayrıca hiPSC’lerin güvenliğini artırmak için cMYC’yi dönüştürmeyen LMYC (küçük hücreli akciğer karsinomu ilişkili MYC) ile değiştirdiler. Bu epizomal plazmidler 5 yeniden programlama faktörünü ifade eder: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC ve TP53için shRNA17,18. Bu vektörler ekstra kromozomal olarak korunur ve sürekli kültür üzerine yeniden programlanan hücrelerden kaybolur, böylece çizgileri 10-15 pasaj içinde transgene-free hale getirir. Nükleofeksiyon, nükleik asitleri doğrudan konak hücrelerin çekirdeğine ulaştıran özel bir elektroporasyon şeklidir. Plazmidlerin çeşitli hücre tiplerine yeniden programlanması için etkili bir yöntemdir. Epizomal plazmidler uygun maliyetlidir ve nükleofeksiyonun yüksek maliyetlerini telafi eder. Bu yöntem, çeşitli somatik hücrelerden kararlı iPSC’ler sağlayan optimize edilmiş koşullar altında verimli ve tekrarlanabilir. Bu protokolde epizomal reprogramlama plazmidlerinin nükleofeksiyonu ile fetal dokudan izole edilen fibroblastlardan iPSC’lerin üretilmesi için yöntemi açıklıyoruz. İşte fetal koryonik villiden fibroblast izolasyonu, plazmid saflaştırma, nükleofeksiyon, kolonilerin yeniden programlama plakasından toplanması ve stabil iPSC’lerin kurulması için ayrıntılı protokoller.
Yeni oluşturulan iPSC’lerde pluripotency özelliklerinin varlığını onaylamak önemlidir. Bu, pluripotency ile ilgili faktörlerin gösterimini içerir (örneğin, alkalin fosfataz ekspresyonu, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; genellikle immünofluoresans veya gen ekspresyon tahlilleri ile gösterilir), üç mikrop tabakasının farklılaşma potansiyellerini doğrulamak için in vitro farklılaşma testleriyle tanımlanması, kromozomal içeriği belirlemek için karyotipleme, ebeveyn hücreleriyle kimlik oluşturmak için STR yazma, eksojen genlerin kaybını doğrulama, ve teratom oluşumu ve tetraploid kompleasyonu gibi daha sıkı in vivo tahliller. Burada karyotipingin karakterizasyon protokollerini, canlı hücreler alkali fosfataz boyamayı, pluripotency ile ilgili biyobelirteçlerin immünofluoresans ile tespitini, in vitro farklılaşma tahlillerini ve eksojen gen kaybını gösterme yöntemini açıklıyoruz19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sitogenetik olarak anormal fetal dokunun stabil hücresel modellerinin üretilmesi, kusurlu fenotipin sürekliliği için gereklidir. iPSC rotası, kusurlu özelliklerin sürekli korunması için hücre hazırlamanın en etkili yöntemidir20.
Pluripotent kök hücreler (PSC), erken bölünme embriyolarını andıran özel hücrelere kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerini gösterir21. Bu nedenle, PSC’ler erken kürtaj yapılan fetüslerd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yukarıdaki araştırma için mali destek Manipal Yükseköğretim Akademisi tarafından sağlanmıştır. Hattın karakterizasyonu kısmen NCBS’deki M.M. Panicker laboratuvarında gerçekleştirildi. Karyotyping konusunda yardım için Anand Tanı Laboratuvarı’ne teşekkür ederiz.
Materials
| 0.15% trypsin | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | G Banding |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| 4', 6 diamidino-2-phenylindole | Sigma Aldrich | D8417 | Immunocytochemistry |
| Activin A | Sigma Aldrich | SRP3003 | Differentiation assays |
| Alkaline Phosphatase Live Stain | Thermo Fisher Scientific | A14353 | AP staining |
| AMAXA Nucleofector II | Lonza | – | Nucleofection |
| AmnioMAX II complete media | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 11269016 | Medium specific for foetal chorionic villi cell cultures |
| Ampicillin | HiMedia | TC021 | Plasmid purification |
| Anti Mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11059 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | Immunocytochemistry |
| Anti Rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11035 | Immunocytochemistry |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15240096 | Contamination control |
| Anti-E-Cadherin | BD Biosciences | 610181 | Immunocytochemistry |
| Anti-Nanog | BD Biosciences | 560109 | Immunocytochemistry |
| Anti-OCT3/4 | BD Biosciences | 611202 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX17 | BD Biosciences | 561590 | Immunocytochemistry |
| Anti-SOX2 | BD Biosciences | 561469 | Immunocytochemistry |
| Anti-SSEA4 | BD Biosciences | 560073 | Immunocytochemistry |
| Anti-TRA 1-81 | Millipore | MAB4381 | Immunocytochemistry |
| basic Fibroblast Growth Factor[FGF2] | Sigma Aldrich | F0291 | Pluripotency medium |
| Bone Morphogenetic Factor 4 | Sigma Aldrich | SRP3016 | Differentiation assays |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A3059 | Blocking |
| Collagen Human Type IV | BD Biosciences | 354245 | Differentiation assays |
| Collagenase blend | Sigma Aldrich | C8051 | Digestion of foetal chorionic villi |
| Dexamethasone | Sigma Aldrich | D4902 | Differentiation assays |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | Differentiation assays |
| FastDigest EcoR1 | Thermo Scientific | FD0274 | Restriction digestion |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2518 | Differentiation assays |
| Giemsa Stain | HiMedia | S011 | G Banding |
| Glacial Acetic Acid | HiMedia | AS001 | Fixative for karyotyping |
| Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | Differentiation assays |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Heparin sodium | Sigma Aldrich | H3149 | Differentiation assays |
| Insulin solution human | Sigma Aldrich | I9278 | Differentiation assays |
| Insulin Transferrin Selenite | Sigma Aldrich | I1884 | Differentiation assays |
| KAPA HiFi PCR kit | Kapa Biosystems | KR0368 | OriP, EBNA1 PCR |
| KaryoMAX Colcemid | Thermo Fisher Scientific | 15210040 | Mitotic arrest for karyotyping |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10829018 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Luria Bertani agar | HiMedia | M1151F | Plasmid purification |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | Differentiation assays |
| MEM Non-essential amino acids | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Methanol | HiMedia | MB113 | Fixative for karyotyping |
| Myosin ventricular heavy chain α/β | Millipore | MAB1552 | Immunocytochemistry |
| NHDF Nucleofector Kit | Lonza | VAPD-1001 | Nucleofection |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | Fixing cells |
| pCXLE-hOCT3/ 4-shp53-F | Addgene | 27077 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | Episomal reprogramming Plasmid |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | Episomal reprogramming Plasmid |
| Penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, | 15070063 | Pluripotency and Embryoid body medium |
| Phalloidin- Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma Aldrich | P1951 | Immunocytochemistry |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | 1 X PBS 1 tablet of PBS dissolved in 200mL of deionized water and sterilized by autoclaving Storage: Room temperature. PBST- 0.05% Tween 20 in 1X PBS. Storage: Room temperature. |
| Plasmid purification Kit- Midi prep | QIAGEN | 12143 | Plasmid purification |
| Potassium Chloride Solution | HiMedia | MB043 | Hypotonic solution for karyotyping |
| QIAamp DNA Blood Kit | Qiagen | 51104 | Genomic DNA isolation |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | Hepatocyte differentiation medium |
| Sodium Citrate | HiMedia | RM255 | Hypotonic solution for karyotyping |
| Triton X-100 | HiMedia | MB031 | Permeabilisation |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 25300054 | Subculture of foetal chorionic villi fibroblasts |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | Preparation of PBST |
| β III tubulin | Sigma Aldrich | T8578 | Immunocytochemistry |
| Y-27632 dihydrochloride | Sigma Aldrich | Y0503 | Differentiation assays |
References
- Verlinsky, Y., et al. Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).
- Eiges, R., et al. Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos. Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).
- Biancotti, J. -. C., et al. Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes. STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).
- Li, W., et al. Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes. Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).
- Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. Turner syndrome: mechanisms and management. Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).
- Luo, Y., et al. Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Discovery. 1, 15022 (2015).
- Luo, Y., et al. Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism. Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).
- Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion. Stem Cell Research. 19, (2017).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Soldner, F., et al. Parkinson’s Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors. Cell. 136, 964-977 (2009).
- Somers, A., et al. Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).
- Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458, 766-770 (2009).
- Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration. Science. 322, 945-949 (2008).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).
- Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).
- Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).
- Yu, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8, 409-412 (2011).
- Martí, M., et al. Characterization of pluripotent stem cells. Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Ambartsumyan, G., Clark, A. T. Aneuploidy and early human embryo development. Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).
