हमने वायरस जैसे कणों के भीतर Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स को लोड करने के लिए एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल विकसित किया है। ये कण, जिन्हें “नैनोब्लेड्स” कहा जाता है, अमर और प्राथमिक कोशिकाओं के साथ-साथ विवो में Cas9 / sgRNA परिसर के कुशल वितरण की अनुमति देते हैं।
Clustered नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR) -कैस प्रणाली यूकेरियोटिक कोशिकाओं में जीनोम-संपादन democratized है और कई अभिनव अनुप्रयोगों के विकास के लिए नेतृत्व किया है। हालांकि, Cas9 प्रोटीन और एकल-गाइड आरएनए (एसजीआरएनए) का लक्ष्य कोशिकाओं में वितरण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हो सकता है। शास्त्रीय वायरल वैक्टर, जैसे कि लेंटिवायरस (एलवी) या एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) से व्युत्पन्न, कैस 9 प्रोटीन और कई प्राथमिक कोशिकाओं और विवो में इसके संबंधित एसजीआरएनए के लिए ट्रांसजीन कोडिंग के कुशल वितरण की अनुमति देते हैं। फिर भी, ये वैक्टर लक्ष्य सेल जीनोम में ट्रांसजीन के एकीकरण, एक सीमित कार्गो क्षमता, और कैस 9 प्रोटीन की दीर्घकालिक अभिव्यक्ति और लक्ष्य कोशिकाओं में आरएनए का मार्गदर्शन करने जैसी कमियों से पीड़ित हो सकते हैं।
इनमें से कुछ समस्याओं को दूर करने के लिए, किसी भी कोडिंग ट्रांसजीन की अनुपस्थिति में कैस 9 प्रोटीन और इससे जुड़े गाइड आरएनए को पैकेज करने के लिए मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) पर आधारित एक डिलीवरी वेक्टर विकसित किया गया था। MLV से संरचनात्मक प्रोटीन गैग के सी-टर्मिनस के लिए Cas9 प्रोटीन को फ्यूज करके, Cas9 प्रोटीन और sgRNA (“Nanoblades” नामक) के साथ लोड किए गए वायरस जैसे कणों (VLPs) का गठन किया गया था। नैनोब्लेड्स को उत्पादक कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम से एकत्र किया जा सकता है, शुद्ध, मात्राबद्ध किया जा सकता है, और लक्ष्य कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करने और सक्रिय कैस 9 / एसजीआरएनए कॉम्प्लेक्स को वितरित करने के लिए उपयोग किया जाता है। Nanoblades अपने राइबोन्यूक्लियोप्रोटीन (RNP) कार्गो को प्राथमिक और अमर कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में क्षणिक और तेजी से वितरित करते हैं और संशोधित Cas9 प्रोटीन का उपयोग करके लक्षित जीन के क्षणिक ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण जैसे अन्य अनुप्रयोगों के लिए प्रोग्राम किए जा सकते हैं। Nanoblades इंजेक्टेड वयस्क चूहों के जिगर में और ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए ocytes में विवो जीनोम-संपादन में सक्षम हैं। अंत में, उन्हें “अभिकर्मक-मुक्त” होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत के लिए दाता डीएनए के साथ जटिल किया जा सकता है। नैनोब्लेड तैयारी सरल, अपेक्षाकृत कम लागत वाली है, और इसे किसी भी सेल जीव विज्ञान प्रयोगशाला में आसानी से किया जा सकता है।
अन्य प्रोग्राम योग्य न्यूक्लिएज की तुलना में, CRISPR-Cas प्रणाली ने यूकेरियोटिक कोशिकाओं में अनुक्रम-विशिष्ट जीनोम लक्ष्यीकरण और दरार की प्रक्रिया को नाटकीय रूप से सरल और लोकतांत्रिक बनाया। एक sgRNA की सरल अभिव्यक्ति के माध्यम से, उपयोगकर्ता लगभग किसी भी सेलुलर लोकस 1 के लिए Cas9 प्रोटीन (या अनुकूलित वेरिएंट) को प्रोग्राम कर सकते हैं। इस परिदृश्य में, Cas9 प्रोटीन और sgRNA का वितरण साइट-निर्देशित म्यूटाजेनेसिस करते समय मुख्य सीमा बन जाता है। अमर कोशिकाओं में, एसजीआरएनए और कैस प्रोटीन को अधिकांश कोशिकाओं में कुशल जीनोम लक्ष्यीकरण प्राप्त करने के लिए ट्रांसफेक्टेड प्लास्मिड से आसानी से व्यक्त किया जा सकता है। हालांकि, Cas9 / sgRNA कॉम्प्लेक्स की संवैधानिक अभिव्यक्ति Cas9 प्रोटीन की ऑफ-टारगेट गतिविधि को बढ़ा सकती है और गैर-विशिष्ट लोकी 2 में अवांछित परिवर्तन पेश कर सकती है। प्राथमिक कोशिकाओं में, डीएनए अभिकर्मक को प्राप्त करना तकनीकी रूप से मुश्किल हो सकता है और खराब अभिव्यक्ति या संक्रमित कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत हो सकता है। क्लासिक डीएनए अभिकर्मक के विकल्पों में वायरल वैक्टर का उपयोग शामिल है जो कैस 9 और एसजीआरएनए के लिए एक ट्रांसजीन कोडिंग या एक सिंथेटिक एसजीआरएनए के साथ युग्मित पुनः संयोजक कैस 9 प्रोटीन के इलेक्ट्रोपोरेशन को वितरित करता है। हालांकि, ये दृष्टिकोण सेल होस्ट जीनोम के भीतर ट्रांसजीन एकीकरण का कारण बन सकते हैं (जैसा कि शास्त्रीय रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल अभिव्यक्ति वैक्टर के मामले में है), सेलुलर कारकों द्वारा प्रतिबंध, और कैस 9 प्रोटीन और एसजीआरएनए की संवैधानिक अभिव्यक्ति का कारण बन सकता है।
Cas9 / sgRNA RNP कॉम्प्लेक्स का इलेक्ट्रोपोरेशन इन समस्याओं में से अधिकांश को दूर कर सकता है और प्राथमिक कोशिकाओं में और विवो में कुशल और क्षणिक वितरण का कारण बन सकता है और साथ ही साथ खुराक-निर्भर प्रतिक्रिया की अनुमति देता है। फिर भी, यह आमतौर पर महंगे उपकरणों और अभिकर्मकों पर निर्भर करता है और यदि बड़ी संख्या में कोशिकाओं का इलाज किया जाना है तो इसे बढ़ाना भी मुश्किल है। उपर्युक्त तकनीकों के विकल्प के रूप में, इन लेखकों ने “नैनोब्लेड्स” विकसित किया है – कैस 9 प्रोटीन और एसजीआरएनए 3 के लिए एक रेट्रोवायरल डिलीवरी वेक्टर जो अवधारणात्मक रूप से अन्य वायरल-व्युत्पन्न कैप्सिड प्रोटीन डिलीवरी सिस्टम 4,5,6,7,8 के समान है। Nanoblades रेट्रोवायरस से गैग पॉलीप्रोटीन की प्राकृतिक क्षमता का उपयोग करने के लिए उत्पादन करते हैं, जब अकेले सुसंस्कृत कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, तो वीएलपी जो बाह्य कोशिकीय माध्यम 9 में जारी किए जाते हैं। कैस 9 प्रोटीन को मुरीन ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी) गैग पॉलीप्रोटीन के सी-टर्मिनल छोर पर फ्यूज करके और एसजीआरएनए और वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन को सह-व्यक्त करके, कैस 9 प्रोटीन को जारी वीएलपी या नैनोब्लेड्स के भीतर एनकैप्सिडेट किया जा सकता है। शुद्धिकरण पर, Nanoblades लक्ष्य कोशिकाओं के साथ incubated किया जा सकता है या Vivo में इंजेक्ट किया जा सकता है तेजी से मध्यस्थता करने के लिए, क्षणिक, और Cas9 / sgRNA RNP complex3 की खुराक निर्भर वितरण.
Nanoblades को विभिन्न लोकी पर एक साथ संपादन के लिए कई sgRNAs के साथ प्रोग्राम किया जा सकता है या Cas9 वेरिएंट के साथ लक्ष्य-विशिष्ट ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण या दमन 3 जैसे अन्य अनुप्रयोगों को निष्पादित करने के लिए। प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन के विपरीत, जो पुनः संयोजक अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है, साहित्य से नए वर्णित कैस वेरिएंट को आसानी से गैग संलयन अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया जा सकता है, जिससे यह एक बहुमुखी मंच बन जाता है। नैनोब्लेड्स को होमोलॉजी-निर्देशित मरम्मत करने के लिए एकल-फंसे हुए और डबल-फंसे हुए ओलिगोडॉक्सीन्यूक्लियोटाइड्स (एसएसओडीएन) के साथ आगे जटिल या लोड किया जा सकता है। नैनोब्लेड उत्पादन अपेक्षाकृत सरल और सस्ता है। इसके अलावा, नैनोब्लेड्स को कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर या दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। आमतौर पर, Nanoblades सबसे अमर और प्राथमिक सुसंस्कृत कोशिकाओं में कुशल, ट्रांसजीन मुक्त जीनोम-संपादन की मध्यस्थता करते हैं। हालांकि, कुछ प्राथमिक कोशिकाएं वायरल कणों की उपस्थिति के प्रति संवेदनशील हो सकती हैं, जिसके परिणामस्वरूप मृत्यु दर में वृद्धि होती है। जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाएं नैनोब्लेड्स की उपस्थिति पर भी प्रतिक्रिया कर सकती हैं (उनके वायरल मूल के कारण) और सक्रिय हो जाती हैं। इन मामलों में, Transduction प्रोटोकॉल Nanoblades के लिए जोखिम समय को सीमित करने और nonspecific प्रभाव को कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना है। Nanoblades अन्य उपलब्ध CRISPR वितरण विधियों के लिए एक व्यवहार्य और आसान करने के लिए लागू विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं।
Nanoblades सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं में Cas9 / sgRNA RNP परिसर के तेजी से और खुराक-निर्भर वितरण के लिए अनुमति देते हैं। शास्त्रीय अभिकर्मक और अन्य वायरल डिलीवरी वैक्टर के विपरीत, लेकिन प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन की तरह, नैनोब्लेड्स में ट्रांसजीन-मुक्त तरीके से कैस 9 / एसजीआरएनए आरएनपी के क्षणिक वितरण का लाभ होता है। Nanoblades प्रोटीन वितरण के लिए एक अत्यधिक बहुमुखी, सरल और सस्ती मंच प्रदान करते हैं जिसे आसानी से और तेजी से CRISPR वेरिएंट के कभी-विस्तारित परिवार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। Nanoblades HEK293T सेल लाइन या इसके डेरिवेटिव में उत्पादित किया जा सकता है। यहां उपयोग की जाने वाली HEK293T सेल लाइनों को रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल कण उत्पादन को अधिकतम करने के लिए विकसित किया गया है (सामग्री की तालिका देखें)। हालांकि, हालांकि HEK293T कोशिकाओं के अन्य स्रोत उपयुक्त हो सकते हैं, उपयोगकर्ताओं को विभिन्न स्रोतों से HEK293T कोशिकाओं का परीक्षण और तुलना करनी चाहिए क्योंकि HEK293T सेल-स्रोत के आधार पर कण उत्पादन में प्रमुख अंतर देखे गए हैं। कोशिकाओं को माइकोप्लाज्मा संदूषण के लिए भी अक्सर जांचा जाना चाहिए और ओवरकॉन्फ्लेंस से बचने के लिए हर तीन दिनों (शास्त्रीय रूप से 1/8 कमजोर पड़ने) में पारित किया जाता है, जिसका कण उत्पादन पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है।
कोशिकाओं को 20 से अधिक मार्गों के लिए बनाए नहीं रखा जाना चाहिए। ग्लूकोज, पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, ग्लूटामाइन, और 10% विघटित भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक डीएमईएम का उपयोग सेल संस्कृति के लिए किया गया था। चूंकि सीरम मूल नैनोब्लेड तैयारी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है, इसलिए बड़े पैमाने पर उत्पादन से पहले सीरम के विभिन्न बैचों का परीक्षण किया जाना चाहिए। Nanoblades को अन्य मीडिया जैसे RPMI या न्यूनतम आवश्यक माध्यम के सीरम-मुक्त संशोधनों में कुशलतापूर्वक उत्पादित किया जा सकता है जो अभिकर्मक के बाद के दिन में DMEM को प्रतिस्थापित कर सकते हैं। जैसा कि नीचे इंगित किया गया है, हालांकि कुछ डीएनए-अभिकर्मक अभिकर्मकों के साथ अभिकर्मक के बाद मध्यम प्रतिस्थापन वैकल्पिक है, यह उस माध्यम को संशोधित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है जिसमें वीएलपी जारी किए जाते हैं, विशेष रूप से कण तैयारी में सीरम के निशान को सीमित करने के लिए। हालांकि, अभिकर्मक से पहले के दिन कम-सीरम न्यूनतम आवश्यक माध्यम में कोशिकाओं की खेती का अभी तक प्रयास नहीं किया गया है।
जैसा कि उल्लेख किया गया है, नैनोब्लेड्स निर्माता कोशिकाओं में प्लास्मिड के मिश्रण के ओवरएक्सप्रेशन पर उत्पादित होते हैं। Overexpression इष्टतम उत्पादन के लिए आवश्यक प्रतीत होता है। दरअसल, इस प्रयोगशाला ने एक निर्माता सेल लाइन विकसित की जहां गैग-पोल-व्यक्त करने वाले निर्माण को एंटीबायोटिक चयन द्वारा स्थिर किया गया था; हालांकि, यह प्रणाली Nanoblades की महत्वपूर्ण मात्रा का उत्पादन करने में विफल रही। इसी तरह का अवलोकन तब किया गया था जब एसजीआरएनए-कोडिंग निर्माण को उत्पादक कोशिकाओं के जीनोम में स्थिर रूप से एकीकृत किया गया था। जैसा कि अन्य कण उत्पादन प्रणालियों के लिए वर्णित है, एक स्थिर सेल लाइन जो नैनोब्लेड्स उत्पादन में शामिल कम से कम कुछ निर्माणों को व्यक्त करती है, उपयोगी हो सकती है; हालांकि, यह निश्चित रूप से supernatant की बड़ी मात्रा के प्रसंस्करण और कणों को शुद्ध करने के लिए एक उपयुक्त तकनीक की आवश्यकता होगी। उपर्युक्त प्रोटोकॉल नैनोब्लेड्स का उत्पादन करने के लिए पसंदीदा प्रक्रिया को रेखांकित करता है जो विशिष्ट अभिकर्मक अभिकर्मकों का शोषण करता है ( सामग्री की तालिका देखें)।
यद्यपि अन्य निर्माताओं से अभिकर्मक अभिकर्मकों को भी सफलता के साथ परीक्षण किया गया है, नैनोब्लेड्स के साथ इस समूह के परिणामों का विशाल बहुमत यहां वर्णित प्रक्रिया का पालन करता है। कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मकों का उपयोग करके कम लागत वाले अभिकर्मक प्राप्त किए जा सकते हैं और अच्छी उत्पादन दक्षता प्राप्त कर सकते हैं; हालांकि, इस विधि को पूरी तरह से अभिकर्मक के बाद के दिन अभिकर्मक माध्यम के प्रतिस्थापन की आवश्यकता होती है और तलछट कण तैयारी में कैल्शियम फॉस्फेट अवशेषों को छोड़ सकता है। निर्माता कोशिकाओं के भीतर Nanoblade घटकों के लिए उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता के अनुरूप यह अवलोकन है कि Cas9 प्रोटीन से जुड़े sgRNas की मात्रा कुशल जीनोम-संपादन के लिए एक सीमित कारक हो सकती है। एसजीआरएनए लोडिंग में सुधार करने के लिए, दो तकनीकी दृष्टिकोण हाल ही में नैनोब्लेड्स के समान प्रोटीन वितरण वैक्टर का उपयोग करके स्वतंत्र समूहों द्वारा विकसित किए गए हैं। ये SGRNA6 के T7 पोलीमरेज़-निर्भर साइटोप्लाज्मिक अभिव्यक्ति के उपयोग पर निर्भर करते हैं या Gag polyprotein6 के लिए बाध्यकारी मध्यस्थता करने के लिए sgRNA अनुक्रम में एक retroviral encapsidation संकेत के अलावा के माध्यम से। ये दृष्टिकोण वास्तव में Nanoblades के भीतर sgRNA लोडिंग में सुधार कर सकते हैं, हालांकि उनका अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है।
लक्ष्य कोशिकाओं का ट्रांसडक्शन प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है। अधिकांश अमर सेल लाइनों में, नैनोब्लेड्स के साथ ट्रांसडक्शन का बहुत कम या कोई साइटोपैथिक प्रभाव नहीं होता है। हालांकि, प्राथमिक कोशिकाओं में, विषाक्तता एक मुद्दा हो सकता है। इसलिए ट्रांसडक्शन को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना है। विशेष रूप से, नैनोब्लेड्स के लिए एक्सपोज़र समय ट्रांसडक्शन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय संशोधित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। संवेदनशील कोशिकाओं जैसे प्राथमिक न्यूरॉन्स या अस्थि मज्जा कोशिकाओं के लिए, माध्यम को बदलने से पहले नैनोब्लेड्स के साथ इनक्यूबेशन के 4-6 घंटे सेल विषाक्तता को कम करते हुए कैस 9 प्रोटीन के कुशल वितरण के लिए अनुमति देता है। इसके अलावा, दूसरों के बीच, कैटिओनिक पॉलिमर जैसे सहायक, कुछ कोशिकाओं में ट्रांसडक्शन की दक्षता में काफी सुधार कर सकते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि नैनोब्लेड्स वीएलपी हैं और एक इम्युनोजेनिक प्रतिक्रिया को प्रेरित कर सकते हैं। यह एक सीमा हो सकती है यदि कुछ प्रकार की प्राथमिक कोशिकाओं के साथ काम करना, जैसे मैक्रोफेज या डेंड्राइटिक कोशिकाएं, जिसमें नैनोब्लेड्स के साथ इनक्यूबेशन जीन अभिव्यक्ति और कोशिकाओं के फेनोटाइप में महत्वपूर्ण परिवर्तन को प्रेरित कर सकती है। यदि मैक्रोफेज और डेंड्राइटिक कोशिकाएं हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल अग्रदूतों (जैसे माउस अस्थि मज्जा कोशिकाओं) से प्राप्त की जाती हैं, तो नैनोब्लेड्स के खिलाफ सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रेरित करने से बचने के लिए पूरी तरह से विभेदित होने से पहले नैनोब्लेड्स के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करना बेहतर होता है। अन्यथा, कैस 9 प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन विभेदित प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ काम करते समय एक व्यवहार्य विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकता है।
नैनोब्लेड्स का उपयोग ट्रांसजेनिक जानवरों को उत्पन्न करने के लिए माउस युग्मनज या भ्रूण को ट्रांसड्यूस करने के लिए विवो में किया जा सकता है। शास्त्रीय रेट्रोवायरल या लेंटिवायरल वैक्टर के समान, उन्हें वयस्क जानवरों से ऊतकों में सीधे इंजेक्ट किया जा सकता है। हालांकि, नैनोब्लेड्स (रेट्रोवायरल और लेंटिवायरल वैक्टर के समान) को मेजबान जानवर की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा निष्क्रिय किया जा सकता है; इसलिए, इंजेक्शन की जाने वाली खुराक को प्रत्येक आवेदन के लिए अनुकूलित किया जाना है। यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इंजेक्शन साइट के करीब ऊतकों के लिए कार्यात्मक वीएलपी के वितरण को भी सीमित कर सकती है। अंत में, लेंटिवायरल वैक्टर के विपरीत, नैनोब्लेड्स ट्रांसजीन-मुक्त होते हैं और एक प्रतिबंधित समय सीमा में कैस 9 वितरित करते हैं। इसलिए, उनका उपयोग जीनोम-वाइड कार्यात्मक स्क्रीनिंग करने के लिए नहीं किया जा सकता है, जिसके लिए कोशिकाओं के चयन पर एसजीआरएनए के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण की आवश्यकता होती है। Nanoblades उपयोगी होते हैं जब तेजी से, खुराक-निर्भर, और ट्रांसजीन-मुक्त जीनोम-संपादन की आवश्यकता होती है20। इसके अलावा, प्रोटीन इलेक्ट्रोपोरेशन के समान, नैनोब्लेड्स डीएनए अभिकर्मक या शास्त्रीय वायरल वैक्टर 3 के माध्यम से कैस 9 / एसजीआरएनए की लंबे समय तक अभिव्यक्ति की तुलना में कम ऑफ-टारगेट प्रभाव का कारण बनते हैं। Nanoblades के भविष्य के विकास इस तरह के आधार संपादन और आरएनए लक्ष्यीकरण के रूप में विभिन्न तकनीकी अनुप्रयोगों के लिए Cas9 वेरिएंट को शामिल करने पर केंद्रित है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को Université de Lyon के Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, कार्यक्रम Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007) के भीतर फ्रांसीसी राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC-ERC0000) द्वारा संचालित किया गया था।
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |