Vi har udviklet en enkel og billig protokol til at indlæse Cas9 / single-guide RNA (sgRNA) ribonukleoproteinkomplekser i viruslignende partikler. Disse partikler, kaldet “Nanoblades”, muliggør effektiv levering af Cas9 / sgRNA-komplekset i udødeliggjorte og primære celler såvel som in vivo.
Det klyngede regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR)-Cas-system har demokratiseret genomredigering i eukaryote celler og ført til udviklingen af adskillige innovative applikationer. Levering af Cas9-proteinet og single-guide RNA (sgRNA) til målceller kan dog være teknisk udfordrende. Klassiske virale vektorer, såsom dem, der stammer fra lentivirus (LER’er) eller adeno-associerede vira (AAV’er), muliggør effektiv levering af transgener, der koder for Cas9-proteinet og dets associerede sgRNA i mange primære celler og in vivo. Ikke desto mindre kan disse vektorer lide af ulemper såsom integration af transgenet i målcellegenomet, en begrænset lastkapacitet og langsigtet ekspression af Cas9-proteinet og styre-RNA i målceller.
For at overvinde nogle af disse problemer blev en leveringsvektor baseret på murine leukæmivirus (MLV) udviklet til at pakke Cas9-proteinet og dets tilhørende guide-RNA i fravær af noget kodende transgen. Ved at fusionere Cas9-proteinet til C-terminus for det strukturelle protein Gag fra MLV blev der dannet viruslignende partikler (VLP’er) fyldt med Cas9-proteinet og sgRNA (kaldet “Nanoblades”) dannet. Nanoblade kan indsamles fra dyrkningsmediet af producentceller, renses, kvantificeres og bruges til at transducere målceller og levere det aktive Cas9 / sgRNA-kompleks. Nanoblades leverer deres ribonukleoprotein (RNP) last forbigående og hurtigt i en lang række primære og udødeliggjorte celler og kan programmeres til andre anvendelser, såsom forbigående transkriptionel aktivering af målrettede gener, ved hjælp af modificerede Cas9-proteiner. Nanoblades er i stand til in vivo-genomredigering i leveren hos injicerede voksne mus og i oocytter til at generere transgene dyr. Endelig kan de komplekseres med donor-DNA til “transfektionsfri” homologistyret reparation. Nanoblade-forberedelse er enkel, relativt billig og kan let udføres i ethvert cellebiologisk laboratorium.
Sammenlignet med andre programmerbare nukleaser forenklede og demokratiserede CRISPR-Cas-systemet dramatisk proceduren for sekvensspecifik genommålretning og spaltning i eukaryote celler. Gennem den enkle ekspression af et sgRNA kan brugerne programmere Cas9-proteinet (eller optimerede varianter) til næsten ethvert cellulært locus1. I dette scenario bliver levering af Cas9-proteinet og sgRNA den største begrænsning ved udførelse af stedstyret mutagenese. I udødeliggjorte celler kan sgRNA og Cas-proteinet let udtrykkes fra transfekterede plasmider for at opnå effektiv genommålretning i de fleste celler. Imidlertid kan konstitutiv ekspression af Cas9/sgRNA-komplekset øge Cas9-proteinets off-target-aktivitet og indføre uønskede ændringer i ikke-specifikke loci2. I primære celler kan DNA-transfektion være teknisk vanskelig at opnå og føre til dårlig ekspression eller en lille procentdel af transfekterede celler. Alternativer til klassisk DNA-transfektion omfatter brugen af virale vektorer, der leverer en transgenkodning for Cas9 og sgRNA eller elektroporation af rekombinant Cas9-protein koblet til et syntetisk sgRNA. Disse tilgange kan imidlertid føre til transgen integration i celleværtsgenomet (som det er tilfældet for klassiske retrovirale og lentivirale ekspressionsvektorer), begrænsning af cellulære faktorer og føre til konstitutiv ekspression af Cas9-proteinet og sgRNA.
Elektroporation af Cas9 / sgRNA RNP-komplekset kan overvinde de fleste af disse problemer og føre til effektiv og forbigående levering i primære celler og in vivo samt tillade et dosisafhængigt respons. Ikke desto mindre er det normalt afhængigt af dyrt udstyr og reagenser og er også vanskeligt at opskalere, hvis et stort antal celler skal behandles. Som et alternativ til de ovennævnte teknikker har disse forfattere udviklet “Nanoblades” – en retroviral leveringsvektor til Cas9-proteinet og sgRNA3, der konceptuelt ligner andre viralt afledte capsidproteinleveringssystemer4,5,6,7,8. Nanoblades udnytter den naturlige kapacitet af Gag-polyproteinet fra retrovirus til at producere, når de udtrykkes alene i dyrkede celler, VLP’er, der frigives i det ekstracellulære medium9. Ved at fusionere Cas9-proteinet til den C-terminale ende af murine leukæmivirus (MLV) Gag-polyproteinet og samtidig udtrykke sgRNA- og virale kuvertglycoproteiner kan Cas9-proteinet indkapsles i frigivne VLP’er eller Nanoblades. Efter oprensning kan Nanoblades inkuberes med målceller eller injiceres in vivo for at formidle hurtig, forbigående og dosisafhængig levering af Cas9/sgRNA RNP-komplekset3.
Nanoblades kan programmeres med flere sgRNA’er til samtidig redigering på forskellige loci eller med Cas9-varianter til at udføre andre applikationer såsom målspecifik transkriptionsaktivering eller undertrykkelse3. I modsætning til proteinelektroporation, der er afhængig af rekombinant ekspression, kan nyligt beskrevne Cas-varianter fra litteraturen let klones ind i Gag-fusionsekspressionsvektoren, hvilket gør den til en alsidig platform. Nanoblade kan yderligere komplekseres eller fyldes med enkeltstrengede og dobbeltstrengede oligodeoxynukleotider (ssODN’er) for at udføre homologistyret reparation3. Nanoblade-produktionen er relativt enkel og billig. Desuden kan Nanoblades opbevares ved 4 °C i mange dage eller ved -80 °C til langtidsopbevaring. Nanoblades formidler typisk effektiv, transgenfri genomredigering i de fleste udødeliggjorte og primærdyrkede celler. Imidlertid kan nogle primære celler være følsomme over for tilstedeværelsen af virale partikler, hvilket resulterer i øget dødelighed. Celler i det medfødte immunsystem kan også reagere på tilstedeværelsen af Nanoblades (på grund af deres virale oprindelse) og blive aktiveret. I disse tilfælde skal transduktionsprotokollen optimeres for at begrænse eksponeringstiden for Nanoblades og minimere uspecifikke effekter. Nanoblades repræsenterer et levedygtigt og let at implementere alternativ til andre tilgængelige CRISPR-leveringsmetoder.
Nanoblades muliggør hurtig og dosisafhængig levering af Cas9/sgRNA RNP-komplekset i cellelinjer og primære celler. I modsætning til klassisk transfektion og andre virale leveringsvektorer, men ligesom proteinelektroporation, har Nanoblades fordelen ved forbigående levering af Cas9 / sgRNA RNP på en transgenfri måde. Nanoblades tilbyder en meget alsidig, enkel og billig platform til proteinlevering, der nemt og hurtigt kan tilpasses den stadigt voksende familie af CRISPR-varianter. Nanoblade kan produceres i HEK293T-cellelinjen eller dens derivater. HEK293T-cellelinjer, der anvendes her, er udviklet til at maksimere retroviral og lentiviral partikelproduktion (se materialetabellen). Men selvom andre kilder til HEK293T-celler kan være egnede, skal brugerne teste og sammenligne HEK293T-celler fra forskellige kilder, da der er observeret store forskelle i partikelproduktionen afhængigt af HEK293T-cellekilden. Celler skal også kontrolleres for Mycoplasma-kontaminering ofte og passeres hver tredje dag (klassisk 1/8 fortynding) for at undgå overkonfluens, hvilket har en negativ indvirkning på partikelproduktionen.
Celler bør ikke opretholdes i over 20 passager. DMEM suppleret med glucose, penicillin/streptomycin, glutamin og 10% dekompileret føtalt kvægserum blev anvendt til cellekultur. Da serumoprindelse kan påvirke kvaliteten af Nanoblade-præparatet, bør forskellige partier serum testes inden storstilet produktion. Nanoblades kan produceres effektivt i andre medier såsom RPMI eller serumfrie modifikationer af minimum essentielt medium, der kan erstatte DMEM dagen efter transfektion. Som angivet nedenfor kan det, selv om medium udskiftning efter transfektion med nogle DNA-transfektionsreagenser er valgfri, være gavnligt at ændre det medium, som VLP’erne frigives til, især for at begrænse serumspor i partikelpræparatet. Imidlertid er dyrkning af celler i reduceret serum minimum essentielt medium dagen før transfektion endnu ikke forsøgt.
Som nævnt produceres Nanoblade ved overekspression af en blanding af plasmider i producentceller. Overekspressionen synes at være nødvendig for optimal produktion. Faktisk udviklede dette laboratorium en producentcellelinje, hvor den Gag-Pol-ekspresserende konstruktion blev stabiliseret ved antibiotikaudvælgelse; dette system kunne imidlertid ikke producere betydelige mængder Nanoblades. En lignende observation blev foretaget, da den sgRNA-kodende konstruktion blev stabilt integreret i genomet af producentceller. Som beskrevet for andre partikelproduktionssystemer kan en stabil cellelinje, der udtrykker i det mindste nogle konstruktioner, der er involveret i Nanoblades-produktion, være nyttig; dette ville dog helt sikkert kræve behandling af store mængder supernatant og en passende teknik til rensning af partikler. Ovenstående protokol skitserer den foretrukne procedure til fremstilling af nanoblade, der udnytter specifikke transfektionsreagenser (se materialetabellen).
Selvom transfektionsreagenser fra andre producenter også er blevet testet med succes, følger langt de fleste af denne gruppes resultater med Nanoblades den procedure, der er beskrevet heri. Lavpristransfektion kan opnås ved anvendelse af calciumphosphatreagenser og give god produktionseffektivitet; Denne metode kræver imidlertid absolut udskiftning af transfektionsmedium dagen efter transfektion og kan efterlade calciumphosphatrester i det sedimenterede partikelpræparat. I overensstemmelse med nødvendigheden af høje ekspressionsniveauer for Nanoblade-komponenter i producentceller er observationen af, at mængden af sgRNA’er forbundet med Cas9-proteinet kan være en begrænsende faktor for effektiv genomredigering. For at forbedre sgRNA-belastningen er der for nylig udviklet to tekniske tilgange af uafhængige grupper, der bruger proteinleveringsvektorer svarende til Nanoblades. Disse er afhængige af anvendelsen af T7-polymeraseafhængig cytoplasmatisk ekspression af sgRNA6 eller gennem tilsætning af et retroviralt indkapslelsessignal til sgRNA-sekvensen for at formidle binding til Gag-polyproteinet6. Disse tilgange kan faktisk forbedre sgRNA-belastningen inden for Nanoblades, selvom de endnu ikke er testet.
Transduktion af målceller er et kritisk trin i proceduren. I de fleste udødeliggjorte cellelinjer har transduktion med Nanoblades ringe eller ingen cytopatisk virkning. I primære celler kan toksicitet imidlertid være et problem. Transduktion skal derfor optimeres for hver celletype. Specifikt er eksponeringstiden for Nanoblades en vigtig faktor at ændre, når transduktionsprotokollen optimeres. For følsomme celler såsom primære neuroner eller knoglemarvsceller giver 4-6 timers inkubation med Nanoblades før udskiftning af mediet mulighed for effektiv levering af Cas9-proteinet, samtidig med at celletoksiciteten minimeres. Desuden kan adjuvanser såsom kationiske polymerer blandt andet forbedre effektiviteten af transduktion i nogle celler betydeligt (se materialetabellen). Det er vigtigt at bemærke, at Nanoblades er VLP’er og kan fremkalde et immunogent respons. Dette kan være en begrænsning, hvis man arbejder med visse typer primære celler, såsom makrofager eller dendritiske celler, hvor inkubation med Nanoblades kan fremkalde vigtige ændringer i genekspression og fænotypen af cellerne. Hvis makrofager og dendritiske celler stammer fra hæmatopoietiske stamcelleprækursorer (såsom museknoglemarvsceller), foretrækkes det at transducere celler med Nanoblades, før de er fuldt differentierede for at undgå at inducere et cellulært respons mod Nanoblades. Ellers kan Cas9-proteinelektroporation udgøre et levedygtigt alternativ, når man arbejder med differentierede immunceller.
Nanoblade kan bruges in vivo til at transducere musezygoter eller embryoner til at generere transgene dyr. I lighed med klassiske retrovirale eller lentivirale vektorer kan de også injiceres direkte i væv fra voksne dyr. Nanoblades (svarende til retrovirale og lentivirale vektorer) kan imidlertid inaktiveres af værtsdyrets immunrespons; Derfor skal den dosis, der skal injiceres, optimeres til hver applikation. Dette immunrespons kan også begrænse fordelingen af funktionelle VLP’er til væv tæt på injektionsstedet. Endelig er Nanoblades i modsætning til lentivirale vektorer transgenfrie og leverer Cas9 inden for en begrænset tidsramme. Derfor kan de ikke bruges til at udføre genom-dækkende funktionelle screeninger, der kræver høj gennemstrømning sekventering af sgRNA’er ved udvælgelse af celler. Nanoblade er nyttige, når der kræves hurtig, dosisafhængig og transgenfri genomredigering20. I lighed med proteinelektroporation fører Nanoblades desuden til færre off-target-effekter end langvarig ekspression af Cas9/sgRNA gennem DNA-transfektion eller klassiske virale vektorer3. Fremtidig udvikling af Nanoblades er fokuseret på at inkorporere Cas9-varianter til forskellige teknologiske anvendelser såsom baseredigering og RNA-målretning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) ved Université de Lyon inden for programmet Investissements d’Avenir (ANR-11-IDEX-0007), der drives af det franske nationale forskningsagentur (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) og af Det Europæiske Forskningsråd (ERC-StG-LS6-805500 til E.P.R.) under EU’s Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogrammer.
13.2 mL, Thinwall Polypropylene Tubes, 14 x 89 mm – 50Pk | Beckman Coulter Life Sciences | 331372 | Ultracentrifugation tubes for Nanoblades purification |
Amersham Protran Premium Western blotting membranes, nitrocellulose | Merck | GE10600004 | Nitrocellulose membrane for quantifying Cas9 levels within purified Nanoblades |
BIC-Gag-CAS9 | Addgene | 119942 | Encodes a GAG (F-MLV)-CAS9(sp) fusion. Allows the production of GAG-CAS9 Virus like particles from producer cells in association with over expressed gRNA(s) and appropriate envelopes |
BICstim-Gag-dCAS9-VPR | Addgene | 120922 | Encodes a GAG-dCAS9-VPR fusion for targeted transcriptional activation |
BLADE | Addgene | 134912 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in Nanoblades system |
BsmBI-v2 | New England Biolabs | R0739S | Restriction enzyme to digest the BLADE and SUPERBLADES vectors for sgRNA cloning |
Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982 | Cell Signaling Technology | 97982S | Anti-Cas9 antibody for Cas9 quantification by dot-blot |
Cas9 Nuclease, S. pyogenes | New England Biolabs | M0386T | Recombinant Cas9 protein to be used as a reference for absolute quantification of the amount of Cas9 loaded within Nanoblades |
Ethidium bromide solution (10 mg/mL in H2O) | Sigma-Aldrich | E1510-10ML | For staining agarose gels and visualize DNA |
Fisherbrand Wave Motion Shakers | Fisher Scientific | 88-861-028 | Agitation table to resuspend Nanoblades upon centrifugation |
gelAnalyzer | http://www.gelanalyzer.com; quantifying band intensity after digestion | ||
Gesicle Producer 293T | Takara | 632617 | Nanoblades producer cell line |
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate | ThermoFisher Scientific | 41966052 | Cell culture medium for Gesicle Producer 293T cells |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7848 | Taq polymerase for amplification of genomic DNA before T7 endonuclease assays |
jetPRIME Transfection Reagent kit for DNA and DNA/siRNA | Polyplus | POL114-15 | Transfection reagent for Nanoblade production in Gesicle Producer 293T cells |
Millex-AA, 0.80 µm, syringe filter | Millipore | SLAA033SS | Syringe filter to remove cellular debris before concentration of Nanoblades |
Millex-GS, 0.22 µm, syringe filter | Millipore | SLGS033SS | Syringe filter to sterilise the sucrose cushion solution |
Millex-HP, 0.45 µm, polyethersulfone, syringe filter | Millipore | SLHP033RS | Syringe filter to remove cellular debris before Nanoblades concentration |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs | T1020L | DNA gel extraction kit for purification of the pBLADES or pSUPERBLADES plasmid fragment upon digestion with BsmBI |
NEB Stable Competent E. coli (High Efficiency) | New England Biolabs | C3040I | Competent bacteria for plasmid transformation and amplification |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740410.50 | Maxipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
Nucleospin gDNA extraction kit | Macherey-Nagel | 740952.50 | Extraction of genomic DNA from transduced cells |
NucleoSpin Plasmid, Mini kit for plasmid DNA | Macherey-Nagel | 740588.50 | Minipreparation kit for purification of plasmid DNA from cultured bacteria |
NucleoSpin Tissue, Mini kit for DNA from cells and tissue | Macherey-Nagel | 740952.5 | Genomic DNA extraction kit |
Optima XE-90 | Beckman Coulter Life Sciences | A94471 | Ultracentrifuge |
pBaEVRless | Els Verhoeyen (Inserm U1111) | Personnal requests have to be sent to: els.verhoyen@ens-lyon.fr | Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs outperform VSV-G-LVs for gene transfer into early-cytokine-stimulated and resting HSCs. Blood 124, 1221–1231 (2014) |
pBS-CMV-gagpol | Addgene | 35614 | Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14200091 | 10X PBS to dilute in millipore water |
Polybrene Transfection Reagent | Millipore Sigma | TR-1003-G | Cationic polymer that enhances the efficiency of retroviral transduction in specific mammalian cells. It can also allow viral-dependent entry of an Oligodeoxynucleotide (ODN) for homology-directed repair |
Sucrose,for molecular biology, ≥99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S0389-5KG | Sucrose to prepare a cushion for Nanoblade purification through ultracentrifugation |
SUPERBLADE5 | Addgene | 134913 | Empty backbone for cloning sgRNA sequence to be used in nanoblades system (Optimized for increased genome editing efficiency via Chen B et al., 2013) |
SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate | ThermoFisher Scientific | 34076 | Enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate for Cas9 dot blots |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter Life Sciences | 331362 | Rotor for ultracentrifugation |
SYBR Safe DNA Gel Stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | Alternative to ethidium bromide for staining agarose gels and visualize DNA |
T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | DNA ligase to ligate the BLADE or SUPERBLADES vectors with the duplexed DNA oligos corresponding to the variable region of the sgRNA |
T7 Endonuclease I | New England Biolabs | M0302S | T7 Endonuclease I recognizes and cleaves non-perfectly matched DNA. Allows to monitor the extent of genome editing at a specific locus |
Triton-containing lysis buffer | Promega | E291A | Lysis buffer to disrupt Nanoblades and allow Cas9 quantification |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | For the preparation of TBST |