Hier wordt een milde 3D-printtechniek gepresenteerd die wordt aangedreven door afwisselend viskeuze-traagheidskrachten om de constructie van hydrogel-microdragers mogelijk te maken. Zelfgemaakte nozzles bieden flexibiliteit, waardoor eenvoudige vervanging voor verschillende materialen en diameters mogelijk is. Celbindende microdragers met een diameter van 50-500 μm kunnen worden verkregen en verzameld voor verdere kweek.
Microdragers zijn kralen met een diameter van 60-250 μm en een groot specifiek oppervlak, die vaak worden gebruikt als dragers voor grootschalige celculturen. Microcarrier-cultuurtechnologie is uitgegroeid tot een van de belangrijkste technieken in cytologisch onderzoek en wordt vaak gebruikt op het gebied van grootschalige celexpansie. Van microdragers is ook aangetoond dat ze een steeds belangrijkere rol spelen bij de bouw van in vitro weefselmanipulatie en klinische screening van geneesmiddelen. Huidige methoden voor het voorbereiden van microcarriers omvatten microfluïdische chips en inkjetprinten, die vaak afhankelijk zijn van een complex stroomkanaalontwerp, een incompatibele tweefasige interface en een vaste nozzle-vorm. Deze methoden worden geconfronteerd met de uitdagingen van complexe nozzleverwerking, ongemakkelijke nozzle-veranderingen en overmatige extrusiekrachten wanneer toegepast op meerdere bioink. In deze studie werd een 3D-printtechniek, alternating viscous-inertial force jetting genoemd, toegepast om de constructie van hydrogel microcarriers met een diameter van 100-300 μm mogelijk te maken. Cellen werden vervolgens gezaaid op microdragers om tissue engineering modules te vormen. In vergelijking met bestaande methoden biedt deze methode een vrije diameter van de spuitmondpunt, flexibele nozzle-omschakeling, vrije controle van afdrukparameters en milde afdrukomstandigheden voor een breed scala aan bioactieve materialen.
Microdragers zijn kralen met een diameter van 60-250 μm en een groot specifiek oppervlak en worden vaak gebruikt voor grootschalige kweek van cellen1,2. Hun buitenoppervlak biedt overvloedige groeiplaatsen voor cellen en het binnenste biedt een ondersteunende structuur voor ruimtelijke proliferatie. De bolvormige structuur biedt ook gemak bij het bewaken en regelen van parameters, waaronder pH, O2 en concentratie van voedingsstoffen en metabolieten. Bij gebruik in combinatie met bioreactoren met geroerde tanks kunnen microdragers hogere celdichtheden bereiken in een relatief klein volume in vergelijking met conventionele culturen, waardoor een kosteneffectieve manier wordt geboden om grootschalige culturen te bereiken3. Microcarrier-cultuurtechnologie is een van de belangrijkste technieken in cytologisch onderzoek geworden en er is veel vooruitgang geboekt op het gebied van grootschalige uitbreiding van stamcellen, hepatocyten, chondrocyten, fibroblasten en andere structuren4. Ze zijn ook ideale voertuigen voor medicijnafgifte en bottom-upeenheden gebleken, waardoor ze een steeds belangrijkere rol spelen bij klinische geneesmiddelenscreening en in vitro weefselmanipulatie5.
Om te voldoen aan de mechanische eigenschapseisen in verschillende scenario’s, zijn meerdere soorten hydrogelmaterialen ontwikkeld voor gebruik bij de constructie van microdragers6,7,8,9,10,11. Hydrogels voor alginaat en hyaluronzuur (HA) zijn twee van de meest gebruikte microcarriermaterialen vanwege hun goede biocompatibiliteit en crosslinkbaarheid12,13. Alginaat kan gemakkelijk worden verknoopt door calciumchloride en de mechanische eigenschappen kunnen worden gemoduleerd door de cross-linking tijd te veranderen. Tyramine-geconjugeerde HA is verknoopt door de oxidatieve koppeling van tyraminemoieties gekatalyseerd door waterstofperoxide en mierikswortelperoxidase14. Collageen, vanwege zijn unieke spiraalstructuur en verknoopt vezelnetwerk, wordt vaak gebruikt als een adjuvans om zich in de microdragers te mengen om celaanhechting verder te bevorderen15,16.
Huidige methoden voor het voorbereiden van microdragers omvatten microfluïdische chips, inkjetprinten en elektrospray17,18,19,20,21,22,23. Het is bewezen dat microfluïdische chips snel en efficiënt zijn in het produceren van microdragers van uniforme grootte24. Deze technologie is echter afhankelijk van een complex ontwerp- en fabricageproces van stroomkanalen25. Hoge temperatuur of overmatige extrusiekrachten tijdens inkjetprinten, evenals intense elektrische velden in de elektrospraybenadering, kunnen de eigenschappen van het materiaal, met name de biologische activiteit ervan, nadelig beïnvloeden19. Bovendien, wanneer toegepast op verschillende biomaterialen en diameters, resulteren de aangepaste nozzles die in deze methoden worden gebruikt in beperkte verwerkingscomplexiteit, hoge kosten en lage flexibiliteit.
Om een handige methode voor de voorbereiding van microcarriers te bieden, is een 3D-printtechniek genaamd alternating viscous-inertial forces jetting (AVIFJ) toegepast om hydrogel-microcarriers te bouwen. De techniek maakt gebruik van neerwaartse aandrijfkrachten en statische druk die wordt gegenereerd tijdens verticale trillingen om de oppervlaktespanning van de mondstukpunt te overwinnen en zo druppels te vormen. In plaats van zware krachten en thermische omstandigheden, werken kleine snelle verplaatsingen direct op het mondstuk tijdens het printen, waardoor een klein effect op de fysisch-chemische eigenschappen van de bioink wordt veroorzaakt en een grote aantrekkingskracht wordt uitgeoefend op bioactieve materialen. Met behulp van de AVIFJ-methode werden met succes microdragers van meerdere biomaterialen met diameters van 100-300 μm gevormd. Bovendien is verder bewezen dat de microdragers cellen goed binden en een geschikte groeiomgeving bieden voor gehechte cellen.
Het hier beschreven protocol geeft instructies voor de bereiding van multi-types hydrogel microcarriers en daaropvolgende celzaaien. In vergelijking met microfluïdische chip- en inkjetprintmethoden biedt de AVIFJ-benadering voor het bouwen van microdragers meer flexibiliteit en biocompatibiliteit. Een onafhankelijk mondstuk maakt het mogelijk om een breed scala aan lichtgewicht nozzles, waaronder glazen micropipettes, te gebruiken in deze printsystemen. De zeer controleerbare verwerking maakt het mogelijk om parameters …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de Beijing Natural Science Foundation (3212007), Tsinghua University Initiative Scientific Research Program (20197050024), Tsinghua University Spring Breeze Fund (20201080760), de National Natural Science Foundation of China (51805294), National Key Research and Development Program of China (2018YFA0703004) en het 111 Project (B17026).
A549 cells | ATCC | CCL-185 | Human non-small cell lung cancer cell line |
Bright field microscope | Olympus | DP70 | |
Confocal microscope | Nikon | TI-FL | |
Fetal bovine serum, FBS | BI | 04-001-1ACS | |
Gelatin | SIGMA | G1890 | |
Glass micropipettes | sutter instrument | b150-110-10 | |
GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
H-DMEM | GIBCO | 11960-044 | Dulbecco's modified eagle medium |
Horseradish peroxidase powder | SIGMA | P6782 | |
Hydrophobic agent | 3M | PN7026 | Follow the manufacturer's instructions and use after dilution |
Micro-forge device | narishige | MF-900 | |
Non-essential amino acids, NEAA | GIBCO | 11140-050 | non-essential amino acids |
Penicillin G and streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Petri dish | SIGMA | P5731-500EA | |
Puller | sutter instrument | P-1000 | |
Sodium alginate | SIGMA | A0682 | |
Trypsin | GIBCO | 25200-056 | |
Type I collagen solution from rat tail | SIGMA | C3867 |