Impression 3D de microporteurs d’hydrogel in vitro par jet de force visqueuse-inertielle alternée

Summary

Présenté ici est une technique d’impression 3D douce entraînée par l’alternance de forces visqueuses-inertielles pour permettre la construction de microporteurs d’hydrogel. Les buses faites maison offrent une flexibilité, permettant un remplacement facile pour différents matériaux et diamètres. Des microtransporteurs de liaison cellulaire d’un diamètre de 50 à 500 μm peuvent être obtenus et collectés pour une culture ultérieure.

Abstract

Les microtransporteurs sont des billes d’un diamètre de 60 à 250 μm et d’une grande surface spécifique, qui sont couramment utilisées comme supports pour les cultures cellulaires à grande échelle. La technologie de culture par microtransporteur est devenue l’une des principales techniques de la recherche cytologique et est couramment utilisée dans le domaine de l’expansion cellulaire à grande échelle. Il a également été démontré que les microtransporteurs jouent un rôle de plus en plus important dans la construction d’ingénierie tissulaire in vitro et le dépistage clinique des médicaments. Les méthodes actuelles de préparation des microporteurs comprennent les puces microfluidiques et l’impression à jet d’encre, qui reposent souvent sur une conception complexe du canal d’écoulement, une interface biphasée incompatible et une forme de buse fixe. Ces méthodes sont confrontées aux défis du traitement complexe des buses, des changements de buse gênants et des forces d’extrusion excessives lorsqu’elles sont appliquées à plusieurs bioencres. Dans cette étude, une technique d’impression 3D, appelée projection de force visqueuse-inertielle alternée, a été appliquée pour permettre la construction de microporteuses en hydrogel d’un diamètre de 100 à 300 μm. Les cellules ont ensuite été ensemencées sur des microtransporteurs pour former des modules d’ingénierie tissulaire. Par rapport aux méthodes existantes, cette méthode offre un diamètre de pointe de buse libre, une commutation flexible de la buse, un contrôle libre des paramètres d’impression et des conditions d’impression douces pour une large gamme de matériaux bioactifs.

Introduction

Les microporteurs sont des billes d’un diamètre de 60 à 250 μm et d’une grande surface spécifique et sont couramment utilisées pour la culture à grande échelle de ^cellules1,2. Leur surface externe fournit des sites de croissance abondants pour les cellules, et l’intérieur fournit une structure de soutien pour la prolifération spatiale. La structure sphérique offre également une commodité dans la surveillance et le contrôle des paramètres, y compris le pH, l’O2 et la concentration de nutriments et de métabolites. Lorsqu’ils sont utilisés en combinaison avec des bioréacteurs à cuve agitée, les microtransporteurs peuvent atteindre des densités cellulaires plus élevées dans un volume relativement faible par rapport aux cultures conventionnelles, offrant ainsi un moyen rentable d’obtenir des cultures à grande ^échelle3. La technologie de culture par microtransporteur est devenue l’une des principales techniques de la recherche cytologique, et de nombreux progrès ont été réalisés dans le domaine de l’expansion à grande échelle des cellules souches, des hépatocytes, des chondrocytes, des fibroblastes et d’autres ^structures4. Ils se sont également avérés être des véhicules d’administration de médicaments idéaux et des unités ascendantes, jouant ainsi un rôle de plus en plus important dans le dépistage clinique des médicaments et la réparation de l’ingénierie tissulaire in vitro5.

Pour répondre aux exigences de propriétés mécaniques dans différents scénarios, plusieurs types de matériaux d’hydrogel ont été développés pour être utilisés dans la construction de microporteurs6,7,8,9,10,11. Les hydrogels d’alginate et d’acide hyaluronique (HA) sont deux des matériaux de microtransporteur les plus utilisés en raison de leur bonne biocompatibilité et de leur réticulabilité12,13. L’alginate peut être facilement réticulé par le chlorure de calcium, et ses propriétés mécaniques peuvent être modulées en modifiant le temps de réticulation. L’AH conjuguée à la tyramine est réticulée par le couplage oxydatif des fractions de tyramine catalysées par le peroxyde d’hydrogène et la peroxydase ^{de raifort14}. Le collagène, en raison de sa structure spirale unique et de son réseau de fibres réticulées, est souvent utilisé comme adjuvant pour se mélanger aux microtransporteurs afin de favoriser davantage l’attachement ^{cellulaire15,16}.

Les méthodes actuelles de préparation des microtransporteurs comprennent les puces microfluidiques, l’impression à jet d’encre et l’électropulvérisation17,18,19,20,21,22,23. Les puces microfluidiques se sont avérées rapides et efficaces dans la production de microporte-porteuses de taille ^uniforme24. Cependant, cette technologie repose sur un processus complexe de conception et de fabrication de canaux ^{d’écoulement25}. Des températures élevées ou des forces d’extrusion excessives lors de l’impression à jet d’encre, ainsi que des champs électriques intenses dans l’approche par électropulvérisation, peuvent nuire aux propriétés du matériau, en particulier à son activité ^biologique19. En outre, lorsqu’elles sont appliquées à divers biomatériaux et diamètres, les buses personnalisées utilisées dans ces méthodes entraînent une complexité de traitement limitée, un coût élevé et une faible flexibilité.

Pour fournir une méthode pratique pour la préparation des microtransporteurs, une technique d’impression 3D appelée jet de forces visqueuses-inertielles alternées (AVIFJ) a été appliquée pour construire des microporte-porteuses d’hydrogel. La technique utilise les forces motrices vers le bas et la pression statique générée lors de vibrations verticales pour surmonter la tension superficielle de la pointe de la buse et ainsi former des gouttelettes. Au lieu de forces sévères et de conditions thermiques, de petits déplacements rapides agissent directement sur la buse pendant l’impression, provoquant un effet mineur sur les propriétés physico-chimiques de la bioencre et présentant un grand attrait pour les matériaux bioactifs. En utilisant la méthode AVIFJ, des microtransporteurs de plusieurs biomatériaux d’un diamètre de 100 à 300 μm ont été formés avec succès. En outre, il a été prouvé que les microtransporteurs lient bien les cellules et fournissent un environnement de croissance approprié pour les cellules adhérentes.

Protocol

1. Culture cellulaire Complétez le milieu essentiel minimum (H-DMEM) modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de solution d’acides aminés non essentiels (NEAA), 1% de pénicilline G et de streptomycine, et 1% de glutamine comme milieu de culture pour les cellules A549. Culture de cellules A549 dans un incubateur à CO2 à 37 °C et avec 5 % de CO2 Dissocier les cellules pour la sous-culture en utilisant la trypsine ?…

Representative Results

Des têtes d’impression de taux de convergence et de diamètres variés ont été fabriquées pour obtenir l’impression de plusieurs types de matériaux. Les buses obtenues avec une résistance à la traction croissante sont illustrées à la figure 1B. Les buses ont été divisées en trois zones : réservoir (III), contraction (II) et tête d’impression (I). Le réservoir était la partie non traitée de la buse, dans laquelle le liquide fournissait une pression statique et une entr?…

Discussion

Le protocole décrit ici fournit des instructions pour la préparation de multi-types de microporteurs d’hydrogel et l’ensemencement cellulaire ultérieur. Par rapport aux méthodes d’impression à puce microfluidique et à jet d’encre, l’approche AVIFJ pour la construction de microporte-porteurs offre une plus grande flexibilité et biocompatibilité. Une buse indépendante permet d’utiliser une large gamme de buses légères, y compris des micropipettes en verre, dans ces systèmes d’impression. Le traite…

Materials

A549 cells	ATCC	CCL-185	Human non-small cell lung cancer cell line
Bright field microscope	Olympus	DP70
Confocal microscope	Nikon	TI-FL
Fetal bovine serum, FBS	BI	04-001-1ACS
Gelatin	SIGMA	G1890
Glass micropipettes	sutter instrument	b150-110-10
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
H-DMEM	GIBCO	11960-044	Dulbecco's modified eagle medium
Horseradish peroxidase powder	SIGMA	P6782
Hydrophobic agent	3M	PN7026	Follow the manufacturer's instructions and use after dilution
Micro-forge device	narishige	MF-900
Non-essential amino acids, NEAA	GIBCO	11140-050	non-essential amino acids
Penicillin G and streptomycin	GIBCO	15140-122
Petri dish	SIGMA	P5731-500EA
Puller	sutter instrument	P-1000
Sodium alginate	SIGMA	A0682
Trypsin	GIBCO	25200-056
Type I collagen solution from rat tail	SIGMA	C3867