Method Article

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

DOI:

10.3791/62252

⸱

April 21st, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomanufacturing Center, Dept. of Mechanical Engineering, Tsinghua University, 2Biomanufacturing and Rapid Forming Technology Key Laboratory of Beijing, 3Department of Mechanical Engineering, Drexel University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

하이드로겔 마이크로캐리어의 시공을 가능하게 하는 점성 관성력을 번갈아 가며 구동되는 온화한 3D 프린팅 기술이 여기에 제시되어 있다. 수제 노즐은 유연성을 제공하므로 다양한 재료와 직경을 쉽게 대체할 수 있습니다. 직경 50-500 μm의 세포 결합 마이크로 캐리어는 추가 배양을 위해 얻어서 수집할 수 있습니다.

Abstract

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마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 대규모 세포 배양을 위한 운반체로 일반적으로 사용되는 큰 특정 표면적을 가진 구슬입니다. 마이크로 캐리어 배양 기술은 세포 학 연구의 주요 기술 중 하나가되었으며 대규모 세포 확장 분야에서 일반적으로 사용됩니다. 마이크로 캐리어는 또한 체외 조직 엔지니어링 건설 및 임상 약물 선별에서 점점 더 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 종종 복잡한 흐름 채널 설계, 호환되지 않는 2 상 인터페이스 및 고정 노즐 모양에 의존하는 미세 유체 칩과 잉크젯 인쇄를 포함한다. 이러한 방법은 여러 바이오잉크에 적용될 때 복잡한 노즐 처리, 불편한 노즐 변경 및 과도한 압출력의 과제에 직면해 있습니다. 이 연구에서는, 번갈아 점성-관성 힘 제팅이라고 불리는 3D 프린팅 기법이 직경 100-300 μm의 하이드로겔 마이크로 캐리어의 건설을 가능하게 하기 위해 적용되었다. 세포는 이후에 조직 공학 모듈을 형성하기 위해 마이크로 캐리어에 시드되었다. 기존 방법에 비해 이 방법은 무료 노즐 팁 직경, 유연한 노즐 스위칭, 인쇄 파라미터의 자유로운 제어, 광범위한 생리활성 재료에 대한 가벼운 인쇄 조건을 제공합니다.

Introduction

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마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 큰 특정 표면적을 가진 구슬이며 일반적으로 세포의 대규모 배양에 사용된다1,2. 그들의 외부 표면은 세포에 대한 풍부한 성장 부위를 제공하고, 내부는 공간 확산을위한 지원 구조를 제공합니다. 구형 구조는 또한 pH, O2 및 영양소와 대사 산물의 농도를 포함한 파라미터를 모니터링하고 제어하는 데 편리함을 제공합니다. 교반탱크 생물반응기와 함께 사용하면 마이크로캐리어는 기존 배양에 비해 상대적으로 적은 부피로 더 높은 세포 밀도를 달성할 수 있어 대규모 배양3를 달성하는 비용 효율적인 방법을 제공한다. 마이크로캐리어 배양 기술은 세포학 연구의 주요 기술 중 하나가 되었으며, 줄기세포, 간세포, 연골세포, 섬유아세포 및 기타 구조물의 대규모 확장 분야에서 많은 진전이 이루어지고 있다. 그(것)들은 또한 이상적인 약 납품 차량 및 상향식 단위로, 그러므로 임상 약 검열 및 체외 조직 공학 수리에 있는 점점 중요한 역할을 취하는 것으로 밝혀졌습니다5.

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Protocol

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1. 세포 배양

  1. 고혈당 덜벡코의 수정된 최소 필수 매체(H-DMEM)를 10% 태아소 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산 용액(NEAA), 1% 페니실린 G 및 연쇄절제술증, 1% 글루타민 보충제를 A549 세포배양매체로 보충한다.
  2. 37°C에서 CO2 인큐베이터에 있는 배양 A549 세포와 5% CO2
  3. 약 80%의 합류에서 트립신을 사용하여 하위 배양을 위한 세포를 해리합니다.
    1. 3mL의 트립신을 사용하여 T75 배양물에서 37°C에서 3분 동안 플라스크를 치료한 다음 배양 배지 6mL을 추가하여 트립시화를 중지합니다.
    2. 느슨하게 부착 된 세포를 수확하는 배양 배지를 피펫.
    3. 원심 분리기 는 72.5 x g 에서 3 분 동안. 상체를 제거하고 신선한 매체의 3mL로 다시 중단합니다.
    4. 1mL의 새로운 T75 배양 플라스크에 1mL의 세포 현탁액을 신선한 배지의 10mL를 함유한다. 2일마다 배양 매체를 변경합니다.

2. 노즐 준비

  1. 제조업체의 지시에 따라 유리 마이크로 파이프를 풀러에 로드합니다. 마이크로 제트 파이프....

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Results

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다양한 수렴속도와 직경의 인쇄헤드는 여러 유형의 재료의 인쇄를 달성하기 위해 제작되었습니다. 당김 강도가 증가하여 얻은 노즐은 도 1B에 도시된다. 노즐은 저수지(III), 수축(II), 프린트헤드(I)의 세 가지 영역으로 나뉘었다. 저수지는 노즐의 처리되지 않은 부분으로, 액체가 인쇄를 위한 정적 압력 및 생체 잉크 입력을 제공했습니다. 수축 지역은 하향 구동력을 생성하는 주요 부분이었다. 당김 강도는 프린트헤드에 큰 영향을 미쳤으며, 확장된 풀 강도로 낮은 수렴률을 보여 줬다. 인쇄 중 표면 장력을 높이고 이산 마이크로드롭렛형성이 더 어려워졌지만, 후속 작업에서 직경이 작은 팁을 절단하는 것이 촉진되었습니다. 그 후, 바늘 위조 기구와 함께, 인쇄헤드는 지정된 직경(도 1C)에서 차단되었다. 100, 120, 150 및 200 μm을 포함한 다양한 직경의 팁은 다양한 체외 미세 조직의 요구 사항을 충족하.......

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Discussion

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여기에 설명된 프로토콜은 다중 유형의 하이드로겔 마이크로 캐리어 및 후속 세포 파종의 제조를 위한 지침을 제공합니다. 미세 유체 칩 및 잉크젯 인쇄 방법에 비해 마이크로 캐리어를 구축하는 AVIFJ 접근 방식은 더 큰 유연성과 생체 적합성을 제공합니다. 독립적인 노즐은 유리 마이크로파이프를 포함한 다양한 경량 노즐을 이러한 인쇄 시스템에 사용할 수 있습니다. 제어성이 높은 처리는 저수지의 부피, 내부 직경 및 인쇄헤드의 모양을 포함한 파라미터를 자유롭게 조정할 수 있게 합니다. 또한 일회용 노즐은 여러 물질 중전환을 위한 살균을 용이하게 하여 반복적인 사용으로 인한 잠재적 오염을 방지합니다. 마지막으로, 작고 빠른 변위는, 대신 심한 힘과 열 조건, 인쇄 공정 동안 노즐에 직접 작용하여 인쇄된 바이오잉크의 원래 물리적 및 화학적 특성을 최대 범위까지 유지한다. 이 기능은 생체 재료 응용 분야에 매우 매력적입니다.

올바른 크기의 마이크로 캐리어의 성공적인 생산을위한 가장 중요한 단.......

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Disclosures

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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이 작품은 베이징 자연과학 재단(3212007), 칭화대학교 이니셔티브 과학 연구 프로그램(20197050024), 칭화대학교 봄바람기금(20201080760), 중국 국립자연과학재단(51805294), 중국 국립지질과학재단(2018YFA0703004), 111개 프로젝트(B17026)가 후원했다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A549 세포ATCCCCL-185인간 비소세포, 폐암 세포주
명시야 현미경올림푸스DP70
컨포칼 현미경니콘TI-FL
소 태아 혈청, FBS, BI,04-001-1ACS
젤라틴, SIGMAG1890
유리 마이크로피펫,셔터 기기b150-110-10
GlutaMAXGIBCO35050-061
H-DMEMGIBCO11960-044Dulbecco의 변형 독수리 배지
양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 분말SIGMAP6782
소수성 제3MPN7026제조업체의 지침을 따르고 희석 후 사용하십시오
Micro-forge 장치narishigeMF-900
비필수 아미노산, NEAAGIBCO11140-050비필수 아미노산
페니실린 G 및 스트렙토마이신GIBCO15140-122
페트리 접시SIGMAP5731-500EA
풀러셔터 기기P-1000
알긴산 나트륨SIGMAA0682
SIGMAC3867
, , , , , , , , , , , , 쥐꼬리 의 Trypsin GIBCO 25200-056 유형 I 콜라겐 용액

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: Achievements and future direction. Biotechnol Advances. 31, 1032-1046 (2013).
  2. Li, B., et al.

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