Vitrifisering av In Vitro Modned Oocytes Samlet fra voksen og prepubertal eggstokkene i sauer
Summary
Protokollen tar sikte på å gi en standardmetode for vitrifisering av voksne og unge saueoocytter. Det inkluderer alle trinnene fra utarbeidelsen av in vitro modningsmedier til den etteroppvarmingskulturen. Oocytter er vitrified på MII scenen ved hjelp av Cryotop for å sikre minimum viktig volum.
Abstract
I husdyr kan in vitro embryoproduksjonssystemer utvikles og opprettholdes takket være det store antallet eggstokker og oocytter som lett kan fås fra et slakteri. Voksne eggstokkene bærer alltid flere antralsekkene, mens i pre-pubertal donorer er maksimalt antall oocytter tilgjengelig ved 4 ukers alder, når eggstokkene bærer topp antall antral follikler. Dermed anses 4 uker gamle lam som gode givere, selv om utviklingskompetansen til prepubertal oocytter er lavere sammenlignet med deres voksne motpart.
Grunnleggende forskning og kommersielle applikasjoner ville bli styrket av muligheten for vellykket kryopreservering vitrified oocytter oppnådd fra både voksne og prepubertal givere. Vitrifiseringen av oocytt samlet fra prepubertal donorer ville også tillate å forkorte generasjonsintervallet og dermed øke den genetiske gevinsten i avlsprogrammer. Imidlertid gjør tapet av utviklingspotensial etter kryopreservering pattedyr oocytter sannsynligvis en av de vanskeligste celletypene å kryopreservere. Blant de tilgjengelige kryopreserveringsteknikkene er vitrifisering mye brukt på dyr og menneskelige oocytter. Til tross for nylige fremskritt i teknikken, induserer eksponeringer for høye konsentrasjoner av kryobeskyttende midler samt kjøleskader og osmotisk stress fortsatt flere strukturelle og molekylære endringer og reduserer utviklingspotensialet til pattedyr oocytter. Her beskriver vi en protokoll for vitrifisering av saueoocytter samlet inn fra unge og voksne givere og modnet in vitro før kryopreservering. Protokollen inkluderer alle prosedyrene fra oocytt in vitro modning til vitrifisering, oppvarming og etteroppvarming inkubasjonsperiode. Oocytter vitrifisert på MII-scenen kan faktisk befruktes etter oppvarming, men de trenger ekstra tid før befruktning for å gjenopprette skade på grunn av kryopreserveringsprosedyrer og for å øke utviklingspotensialet. Dermed er postvarmende kulturforhold og timing avgjørende skritt for restaurering av oocytt utviklingspotensial, spesielt når oocytt samles fra ungdomsdonorer.
Introduction
Langsiktig lagring av de kvinnelige gametene kan tilby et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel å forbedre husdyravl ved hjelp av genetiske utvalgsprogrammer, bidra til å bevare biologisk mangfold gjennom ex-situ wildlife arts bevaringsprogram, og øke in vitro bioteknologi forskning og applikasjoner takket være tilgjengeligheten av lagrede oocytter som skal innlemmes i in vitro embryo produksjon eller kjernefysisk transplantasjon programmer1,2,3. Juvenil oocytt vitrifisering vil også øke genetisk gevinst ved å forkorte generasjonsintervallet i avlsprogrammer4. Vitrifisering ved ultraraske kjøling og oppvarming av oocytter regnes for tiden som en standard tilnærming for husdyr oocytter kryopreservering5. I drøvtyggere, før vitrifisering, blir oocytter vanligvis modnet in vitro, etter gjenfinning fra follikler hentet fra abattoir-avledede eggstokkene2. Voksen, og spesielt prepubertal eggstokkene4,6, kan faktisk levere et nesten ubegrenset antall oocytter som skal kryopreserveres.
Hos storfe, etter oocytt vitrifisering og oppvarming, blastocyst utbytter på >10% har blitt ofte rapportert av flere laboratorier i løpet av det siste tiåret3. Men i små drøvtyggere er oocytt vitrifisering fortsatt ansett som relativt ny for både juvenile og voksne oocytter, og en standardmetode for sau oocytt vitrifisering gjenstår å etablere2,5. Til tross for nylige fremskritt presenterer den vitrifiserte og varmede oocytten faktisk flere funksjonelle og strukturelle endringer som begrenser deres utviklingspotensial7,8,9. Dermed har få artikler rapportert blastocyst utvikling på 10% eller mer i vitrified / oppvarmet sau oocytter2. Flere tilnærminger har blitt undersøkt for å redusere de ovennevnte endringene: optimalisering av sammensetningen av vitrifiserings- og opptiningsløsningene10,11; eksperimentere med bruk av forskjellige kryo-enheter8,12,13; og bruke spesifikke behandlinger under in vitro modning (IVM)4,14,15 og/eller under restitusjonstiden etter oppvarming6.
Her beskriver vi en protokoll for vitrifisering av saueoocytter samlet inn fra unge og voksne givere og modnet in vitro før kryopreservering. Protokollen inkluderer alle prosedyrene fra oocytt in vitro modning til vitrifisering, oppvarming og post-oppvarming kultur periode.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oocyte kryopreservering hos husdyr kan tillate ikke bare langsiktig bevaring av kvinnelige genetiske ressurser, men også fremme utviklingen av embryonale bioteknologier. Dermed vil utviklingen av en standardmetode for oocytt vitrifisering være til nytte for både husdyr og forskningssektoren. I denne protokollen presenteres en komplett metode for voksen sau oocytt vitrifisering og kan representere et solid utgangspunkt for utvikling av et effektivt vitrifiseringssystem for ungdomsoocytt.
En …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne fikk ingen konkrete midler til dette arbeidet. Professor Maria Grazia Cappai og Dr. Valeria Pasciu er takknemlig anerkjent for video voiceover og for å sette opp laboratoriet under videoproduksjon.
Materials
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell’Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), 1115-1129 (2011).
