Multiparameter परफ्यूजन नियंत्रण के साथ प्राथमिक चूहा हेपेटोसाइट्स का अलगाव
Summary
यह प्रोटोकॉल एक विशेष अंतःशिरा कैथेटर के उपयोग का विवरण देता है, मानकीकृत बाँझ डिस्पोजेबल ट्यूबिंग, वास्तविक समय की निगरानी द्वारा पूरक तापमान नियंत्रण, और दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के लिए एक अलार्म प्रणाली के उपयोग का विवरण देता है ताकि अलग-थलग प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स की व्यवहार्यता, उपज और कार्यक्षमता में स्थिरता में सुधार हो सके।
Abstract
प्राथमिक हेपेटोसाइट्स व्यापक रूप से जिगर की बीमारियों पर बुनियादी अनुसंधान में और विट्रो में विषाक्तता परीक्षण के लिए उपयोग किया जाता है। प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, विशेष रूप से पोर्टल शिरा कैनुलेशन में। प्रक्रिया भी कभी-कभी संदूषण और परफ्यूजन सेटअप के असेंबली, अनुकूलन, या रखरखाव में कठिनाइयों के कारण परफ्यूजन स्थितियों में भिन्नताओं के लिए प्रवण है। यहां, मल्टीपैरामीटर परफ्यूजन नियंत्रण के साथ एक बेहतर दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स को प्रक्रिया के महत्वपूर्ण चरणों में आवश्यक तकनीकी सावधानियां बरतते हुए सफलतापूर्वक और मज़बूती से अलग किया गया था, और परिचालन कठिनाई को कम करके और एक विशेष अंतःशिरा कैथेटर, मानकीकृत बाँझ डिस्पोजेबल टयूबिंग, तापमान नियंत्रण, और वास्तविक समय की निगरानी और अलार्म प्रणाली को अपनाने के माध्यम से परफ्यूजन पैरामीटर की परिवर्तनशीलता को कम करके। पृथक प्राथमिक चूहा हेपेटोसाइट्स लगातार उच्च सेल व्यवहार्यता (85% -95%), उपज (2-5 x 108 कोशिकाओं प्रति 200-300 ग्राम चूहा) और कार्यक्षमता (एल्ब्यूमिन, यूरिया और सीवाईपी गतिविधि) का प्रदर्शन करते हैं। प्रक्रिया को एक एकीकृत परफ्यूजन प्रणाली द्वारा पूरक किया गया था, जो एसेप्टिक ऑपरेशन को सुनिश्चित करने के लिए लैमिनर फ्लो हुड में स्थापित करने के लिए पर्याप्त कॉम्पैक्ट है।
Introduction
प्राथमिक हेपेटोसाइट्स जिगर से संबंधित बुनियादी अनुसंधान, रोग उपचार और दवा परीक्षण जैसे आवेदन के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। प्राथमिक हेपेटोसाइट अलगाव के लिए वर्तमान स्वर्ण मानक दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया 1,2,3 है जिसे1970 के दशक में सेग्लेन द्वारा पेश किया गयाथा। हालांकि, यह प्रक्रिया तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और नौसिखिए सर्जनों द्वारा किए जाने पर उच्च विफलता दर है। यहां तक कि जब एक परफ्यूजन को सफल माना जाता है, तो हेपेटोसाइट व्यवहार्यता (आमतौर पर 60% -95%) और उपज (0.5-5 x 108 प्रति 200-300 ग्राम चूहा) में भारी अंतर अलगाव के बीच देखा जा सकता है। यह डाउनस्ट्रीम प्रयोगों की गुणवत्ता और पैमाने को प्रभावित करता है। तकनीकी प्रक्रिया के अलावा, अलगाव के लिए उपयोग किया जाने वाला परफ्यूजन सेटअप, या तो व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है या कस्टम निर्मित, एक योगदान कारक है। परफ्यूजन सेटअप के असेंबली, ऑप्टिमाइज़ेशन और रखरखाव पर ध्यान दिया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य तकनीकी प्रक्रिया के मल्टीपैरामीटर परफ्यूजन नियंत्रण और दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के परफ्यूजन सेटअप के माध्यम से प्राथमिक चूहे हेपेटोसाइट्स के अलगाव के बीच सफलता दर और स्थिरता में सुधार करना है।
तकनीकी पहलू से, प्रक्रिया में सबसे कठिन कदम पोर्टल शिरा कैनुलेशन है। अन्य चरणों के लिए, यदि अच्छा अभ्यास देखा जाता है और सामान्य सावधानी बरती जाती है, तो अलगाव की स्थिरता में सुधार किया जा सकता है। इसलिए, प्रत्येक चरण के लिए तर्क की समझ महत्वपूर्ण है ताकि सर्जन प्रक्रिया के दौरान होने वाले विभिन्न चरों का जवाब दे सके।
हेपेटोसाइट्स और जिगर के अलगाव के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल चूहे और माउस से गैर-पैरेन्काइमल कोशिकाओंको 1,2,5,6,7,8,9 प्रकाशित किया गया है। इन प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले परफ्यूजन सेटअप के कई नुकसान थे, जिनमें परफ्यूजन ट्यूबिंग का पुन: उपयोग, तापमान नियंत्रण के साथ समस्याएं, परफ्यूजन पैरामीटर के नियमित अनुकूलन की आवश्यकता, और / या पोर्टल शिरा कैनुलेशन के लिए अनुपयुक्त प्रकार के अंतःशिरा (IV) कैथेटर का उपयोग शामिल है। परफ्यूजन ट्यूबिंग का पुन: उपयोग संदूषण की संभावना को बढ़ाएगा, खासकर अगर टयूबिंग को ठीक से साफ और कीटाणुरहित नहीं किया गया था। नियमित प्रतिस्थापन के बिना टयूबिंग का पुन: उपयोग भी लीक टयूबिंग या कनेक्टर्स, भरा हुआ बुलबुला जाल और संकुचित ट्यूबिंग जैसी समस्याओं के लिए परफ्यूजन सेटअप को उजागर करेगा, जिनमें से सभी परफ्यूसेट दबाव और प्रवाह दर को काफी हद तक कम कर देंगे, इस प्रकार, यकृत पाचन दक्षता को प्रभावित करेंगे। तापमान नियंत्रण के लिए कुछ सेटअप में एक निरंतर गर्मी स्रोत के बिना, पूर्व-गर्म बफ़र्स समय के साथ ठंडा हो जाएगा, जिससे कम कोलेजनेस गतिविधि और पाचन होगा। यद्यपि अन्य सेटअप बफर को गर्म करने के लिए एक पानी के संचारक से जुड़े एक जैकेट वाले ग्लास कंडेनसर का उपयोग करते हैं, वे भारी होते हैं और सावधानीपूर्वक सफाई की आवश्यकता होती है। कैथेटर से बाहर निकलने वाले बफर के तापमान, दबाव और प्रवाह दर को मापा जाना चाहिए और स्थिर परफ्यूजन स्थिति को सुनिश्चित करने के लिए अलगाव की शुरुआत से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। अनुकूलन के बाद भी, पैरामीटर अभी भी ऑपरेटर के कार्यों के कारण अलगाव के दौरान आधे रास्ते में बदल सकते हैं, जिससे सबऑप्टिमल परफ्यूजन और पाचन होता है। अधिकांश प्रकार के IV कैथेटर पोर्टल शिरा कैनुलेशन के लिए उपयुक्त नहीं हैं क्योंकि वे कैनुलेशन के दौरान निरंतर परफ्यूजन की अनुमति नहीं देते हैं। वे तुरंत सर्जन को सूचित करने में असमर्थ हैं जब कैनुलेशन सफल होता है। इसके अलावा, इसे विकृत किए बिना नरम कैथेटर पर पोर्टल नस को सुरक्षित करना चुनौतीपूर्ण है।
यहां, हम मानकीकृत डिस्पोजेबल बाँझ टयूबिंग, सटीक और स्थिर तापमान नियंत्रण के लिए एक सिलिकॉन हीटर जैकेट, डेटा भंडारण और प्रबंधन के साथ वास्तविक समय की निगरानी और अलार्म सिस्टम और एक विशेष IV कैथेटर के उपयोग का उपयोग करके इन समस्याओं को संबोधित करते हैं, जो कैनुलेशन के दौरान पोर्टल नस को पंक्चर करते समय निरंतर परफ्यूजन की अनुमति देता है। हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, हम इन सभी सुविधाओं को एक एकीकृत परफ्यूजन सिस्टम (आईपीएस) में संयोजित करने वाले पहले समूह हैं जो कॉम्पैक्ट है, जिससे यह अत्यधिक पोर्टेबल हो जाता है और एसेप्टिक ऑपरेशन सुनिश्चित करने के लिए एक लैमिनर प्रवाह हुड में फिट होने में सक्षम होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
कुछ बिंदु हैं जो सामान्य रूप से दो-चरणीय कोलेजेनेस परफ्यूजन प्रक्रिया के लिए विशेष रूप से निरीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, जिगर को उच्छेदन करते समय विशेष देखभाल की जानी चाहिए। सुनिश्चि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम MOE ARC (MOE2017-T2-1-149) द्वारा भाग में समर्थित है; NUHS इनोवेशन बीज अनुदान 2017 (NUHSRO/ 2017/051/InnovSeed/02); सिंगापुर के Mechanobiology संस्थान (R-714-106-004-135); और बायोइंजीनियरिंग और नैनो टेक्नोलॉजी संस्थान, बायोमेडिकल रिसर्च काउंसिल, विज्ञान, प्रौद्योगिकी और अनुसंधान एजेंसी (ए * स्टार) (परियोजना संख्या IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 और MedCaP-LOA-18-02) हैनी यू को वित्त पोषण। एनजी चैन वे सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय के एक शोध विद्वान हैं। हम हेपेटोसाइट शुद्धता विश्लेषण में मदद और सलाह के लिए सिंगापुर के राष्ट्रीय विश्वविद्यालय की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी यूनिट और फ्लो साइटोमेट्री यूनिट को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
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