이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
진행중인 SARS-CoV-2 전염병의 진단은 전 세계 모든 국가의 우선 순위입니다. 현재 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)은 영구적인 솔루션을 사용할 수 없기 때문에 SARS-CoV-2 진단의 황금 표준입니다. 이 기술이 아무리 효과적일 수 있지만, 특히 낮은 풍부 표적과 관련하여 탐지 및 진단의 한계를 보여주는 연구가 나타났습니다. 대조적으로, qPCR보다 우수한 장점을 가진 최근 신기술인 액적 디지털 PCR(ddPCR)은 낮은 풍부 표적 샘플에서 SARS-CoV-2 진단에서 RT-qPCR의 문제를 극복하는 것으로 나타났습니다. 이 기사에서는 2색 검출 시스템을 사용하여 심플렉스, 듀플렉스, 트리플렉스 프로브 믹스 및 쿼드러플렉스 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줌으로써 RT-ddPCR의 기능을 더욱 확장합니다. SARS-CoV-2 게놈(N, ORF1ab, RPP30 및 RBD2)의 특정 부위를 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하여 이러한 분석법의 개발이 가능한 것으로 나타났습니다. 또한 분석 워크플로를 개선하고 데이터를 분석하는 방법에 대한 단계별 세부 프로토콜, 메모 및 제안이 제공됩니다. 향후 작업에서 이 워크플로우를 조정하면 작은 샘플에서 최대 수의 표적을 민감하게 검출할 수 있어 비용과 샘플 처리량이 크게 향상됩니다.
서론
잘 알려진 기술인 중합효소연쇄반응(PCR)은 핵산 연구에 대한 해답을 제공할 수 있는 강력한 기술이 되기 위해 등장한 이후 여러 가지 변형을 거쳤습니다. 이러한 변형은 이전 기술의 지속적인 개선이었습니다. 이러한 변형은 3세대로 요약할 수 있다1. 1세대는 증폭된 표적을 정량화하고 검출하기 위해 겔 전기영동에 의존하는 기존 PCR입니다. 2세대는 실시간으로 시료를 검출할 수 있는 정량적 실시간 PCR(qPCR)이며 표준 곡선을 사용하여 시료의 표적을 직접 정량화할 수 있습니다. 3세대 디지털 PCR(dPCR)은 표준 곡선 없이 핵산 표적의 검출 및 절대 정량을 모두 수행할 수 있습니다. dPCR은 또한 액적 기반 디지털 PCR2에서 볼 수 있는 것과 동일한 웰 내에서 벽의 웰에 의해 오일, 물 및 안정화 화학 물질의 에멀젼으로 분리되는 반응 챔버에서 더욱 개선되었습니다. 액적 디지털 PCR(ddPCR)에서 샘플은 나중에 푸아송 통계 2,3,4를 사용하여 정량화될 개별 표적을 포함하는 수천 나노리터 크기의 액적으로 분할됩니다. 이 기술은 ddP....
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프로토콜
윤리적 진술
우한 바이러스 연구소(WHIOV)는 SARS-CoV-2에 대한 연구를 수행하고 임상 샘플에서 COVID-19를 검출하기 위해 우한시의 중국 CDC에서 승인한 실험실 및 기관 중 하나입니다. 임상 샘플을 사용한 COVID-19에 대한 새로운 진단 기술 개발에 대한 연구도 우한 바이러스 연구소 윤리 위원회(2020FCA001)의 승인을 받았습니다.
1. 샘플 처리 워크플로(그림 1A)
참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 처리(추출 및 보관), 시약/마스터믹스 준비 및 보관, 반응 혼합물 준비(샘플 및 마스터믹스) 및 검출을 위한 전용 파이펫이 있는 별도의 공간을 사용하는 것이 중요합니다. 개발되는 분석법은 임상 샘플 또는 연구 샘플의 검출에 사용될 수 있다. 모든 샘플은 안전한 실험실 절차를 사용하는 경우에도 감염원을 전염시킬 수 있는 것처럼 취급해야 합니다. 샘플 처리 단계는 적절한 개인 보호 장비(PPE) 착용을 포함하여 엄격한 BSL-2 규칙에 따라 생물안전 레벨 2(BSL-2) 실험실에서 수행해야 합니다.
- 샘플 비활성화
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결과
개념 증명 연구에서, 다중 분석 분석 성능은 임상 및 연구 샘플19에 대해 테스트되었습니다. 멀티플렉스 분석의 성능은 RT-PCR19의 성능보다 우수했습니다. 액적 수가 적으면 액적 생성 중에 문제가 발생할 수 있으므로 이 기사에서는 경험적 데이터를 기반으로 웰당 10,000개의 액적 컷오프를 설정했습니다.
비 간섭을 최소화하면서 양수 물방울과 음수 물방울을 잘 분리하면 데이터 분석에 도움이 될 수 있습니다. 따라서 좋은 실험에서는 분석 최적화가 핵심입니다19. 도 2D의 온도 구배 분석 결과에서 볼 수 있듯이, 높은 어닐링 온도(예를 들어, 65°C)는 이중 분석(N(FAM) 및 RPP30(HEX))이 실행되었을 때 음의 액적으로부터 양의 액적을 명확하게 구별할 수 없었다. 그러나, 어닐링 온도가 .......
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토론
SARS-CoV-2 검출을 위한 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 리소스는 거의 없습니다. 이 기사에서는 사용되지 않지만 알려진 사본이 있는 표준 샘플을 사용하여 분석을 개발하고 최적화할 수 있습니다. 그러나 이 작업에서는 Vero-E6 세포에서 성장한 SARS-CoV-2 샘플을 인간 게놈 RNA의 배경에 스파이크하여 분석을 개발하기 위한 표준 샘플로 사용했습니다. 적절한 프라이머 및 프로브 서열은 분석을 개발할 때 필수적입니다. SARS-CoV-2 RT-ddPCR에 대한 대부분의 예비 작업은 ORF1ab 및 N 유전자를 표적으로 하는 중국 CDC 프라이머와 프로브를 사용했기 때문에 이 작업에 포함되기에 적합하다는 것을 발견했습니다 7,8,9,10,11.
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공개 사항
저자는 공개 할 갈등이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 중국 보건부의 전염병 통제 메가 프로젝트(보조금 번호 2017ZX10302301-005) 및 중국-아프리카 공동 연구 센터(보조금 번호 SAJC201605)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 32채널 전자동 핵산 추출기 정수기 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | RNA용 자동 추출기 |
| 프로브용 AutoDG 오일 | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG 소모품 |
| ddPCR 96웰 플레이트 | 프로브용 BioRad | 12003185 | |
| ddPCR 슈퍼믹스(dUTP 없음) | BioRad | 1863024 | ddPCR 분석 마스터믹스 제작 |
| DG32 AutoDG 카트리지 | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG 소모품 |
| 전자 온도 조절 수조 냄비 | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | 샘플의 열 비활성화 |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA 추출 키트 | Genfine Biotech | FMY502T5 | 비활성화된 RNA 샘플의 마그네틱 비드 추출 |
| 피어시블 포일 히트 씰 | 1814040 | ||
| 피펫 팁 | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG 소모품 |
| 피펫 팁 AutoDG용 Pipet 팁 쓰레기통 | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG 소모품 |
| PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA 생성 |
| PX1 PCR 플레이트 씰러 | BioRad | 1814000 | 액적 플레이트 밀봉 AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 소프트웨어 | BioRad | 10026368 | 데이터 수집 및 분석 |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | 데이터 분석 |
| QX200 자동 액적 제레레이터(AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG 소모품 |
| QX200 액적 리더 | BioRad | 1864003 | 액적 판독 및 데이터 수집 |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | 액적 표적 증폭(PCR) 및 cDNA 생성 |
참고문헌
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E.
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재인쇄 및 허가
