الحث الموجه للعضويات الشبكية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
باستخدام طريقة التنظيم الذاتي ، نقوم بتطوير بروتوكول مع إضافة COCO يمكن أن يزيد بشكل كبير من توليد المستقبلات الضوئية.
Abstract
زرع خلايا الشبكية هو نهج علاجي واعد ، والذي يمكن أن يعيد بنية الشبكية ويستقر أو حتى يحسن القدرات البصرية للشبكية المتدهورة. ومع ذلك، يواجه التقدم المحرز في العلاج ببدائل الخلايا حاليا تحديات تتطلب مصدرا جاهزا لشبكية العين البشرية عالية الجودة والموحدة. لذلك ، هناك حاجة إلى بروتوكول سهل ومستقر للتجارب. هنا ، نقوم بتطوير بروتوكول محسن ، يعتمد على طريقة التنظيم الذاتي باستخدام جزيئات خارجية المنشأ والكاشف A بالإضافة إلى الاستئصال اليدوي لتوليد عضويات شبكية العين البشرية ثلاثية الأبعاد (RO). يعبر RO المشتق من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (PSCs) عن علامات محددة للمستقبلات الضوئية. مع إضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف ، تزداد كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط بشكل كبير. الاستخدام الفعال لهذا النظام ، الذي له فوائد خطوط الخلايا والخلايا الأولية ، وبدون مشاكل المصادر المرتبطة بالأخير ، يمكن أن ينتج خلايا شبكية متقاربة ، وخاصة المستقبلات الضوئية. وبالتالي ، فإن التمايز بين PSCs و RO يوفر منصة مثالية وذات صلة بيولوجية لنمذجة الأمراض وفحص الأدوية وزرع الخلايا.
Introduction
تتميز الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSCs) بتجديدها الذاتي وقدرتها على التمايز إلى جميع أنواع الخلايا الجسدية. وهكذا ، أصبحت المواد العضوية المشتقة من PSCs موردا مهما في أبحاث الطب التجديدي. يتميز تنكس الشبكية بفقدان المستقبلات الضوئية (القضبان والمخاريط) وظهارة صبغة الشبكية. يمكن أن يكون استبدال خلايا الشبكية علاجا مشجعا لهذا المرض. ومع ذلك ، ليس من الممكن الحصول على شبكية العين البشرية لأبحاث الأمراض وعلاجها. لذلك ، فإن عضويات الشبكية (ROs) المشتقة من PSCs ، والتي تلخص بشكل فعال وناجح خلايا الشبكية الأصلية متعددة الطبقات ، مفيدة للبحوث الأساسية والانتقالية1،2،3. يركز بحثنا على تمايز RO لتوفير خلايا كافية وعالية الجودة لدراسة تنكس الشبكية4.
طرق التمييز بين ROs آخذة في الظهور باستمرار ، مع تمايز التعليق ثلاثي الأبعاد (3D) الرائد من قبل مختبر ساساي في عام 20125. قدمنا علامة CRX-tdTomato في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لتتبع خلايا سلائف المستقبلات الضوئية على وجه التحديد وعدلنا الطريقة بإضافة COCO ، وهو مضاد متعدد الوظائف لمسارات Wnt و TGF-β و BMP6. وقد ثبت أن COCO يحسن بكفاءة كفاءة كفاءة التمايز بين سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط 6,7.
إجمالا ، من خلال تعديل طريقة التمايز الكلاسيكية ، قمنا بتطوير بروتوكول يمكن الوصول إليه لحصاد سلائف المستقبلات الضوئية والمخاريط الوفيرة من ROs البشرية لتحليل مرض الشبكية المرتبط بالمستقبلات الضوئية من خلال التحقيقات المختبرية ولمزيد من التطبيق السريري / الزرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
التمايز العضوي للشبكية هو طريقة مرغوب فيها لتوليد خلايا شبكية وظيفية وافرة. RO هو مركب من خلايا شبكية العين المختلفة ، مثل الخلايا العقدية ، والخلايا ثنائية القطب ، والمستقبلات الضوئية ، التي تولدها الخلايا الجذعية متعددة القدرات نحو شبكية العين العصبية4،5،</sup…
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبر 502 على دعمهم الفني وتعليقاتهم المفيدة فيما يتعلق بالمخطوطة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية لبلدية بكين (Z200014) والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
