从人多能干细胞中定向诱导视网膜类器官
Summary
使用自组织方法，我们开发了一种添加COCO的协议，可以显着增加光感受器的产生。
Abstract
视网膜细胞移植是一种很有前途的治疗方法，它可以恢复视网膜结构并稳定甚至改善退化视网膜的视觉能力。然而，细胞替代疗法的进展目前面临着需要高质量和标准化人类视网膜的现成来源的挑战。因此，实验需要一个简单稳定的方案。在这里，我们开发了一种优化的方案，基于自组织方法，使用外源性分子和试剂A以及手动切除来生成三维人视网膜类器官（RO）。人多能干细胞（PSCs）衍生的RO表达光感受器的特异性标志物。随着多功能拮抗剂COCO的加入，光感受器前体和锥细胞的分化效率显着提高。该系统的有效使用具有细胞系和原代细胞的优点，并且没有与后者相关的来源问题，可以产生汇合的视网膜细胞，尤其是光感受器。因此，PSCs与RO的分化为疾病建模，药物筛选和细胞移植提供了最佳的生物相关平台。
Introduction
多能干细胞（PSC）的特点是其自我更新和分化成各种体细胞的能力。因此，源自PSCs的类器官已成为再生医学研究的重要资源。视网膜变性的特征是光感受器（视杆细胞和视锥细胞）和视网膜色素上皮的丧失。视网膜细胞置换可能是这种疾病的一种令人鼓舞的治疗方法。然而，获得人类视网膜用于疾病研究和治疗是不可行的。因此，源自 PSC 的视网膜类器官 （RO） 可有效且成功地概括多层天然视网膜细胞，有利于基础和转化研究1，2，3。我们的研究重点是RO分化，为研究视网膜变性提供充足和优质的细胞4。
区分RO的方法不断涌现，Sasai实验室于2012年率先采用三维（3D）悬浮液区分5。我们在人类胚胎干细胞（hESCs）中引入了CRX-tdTomato标签，以特异性跟踪感光器前体细胞，并通过添加COCO（Wnt，TGF-β和BMP途径的多功能拮抗剂6）来修改方法。COCO已被证明可以有效地提高感光器前体和视锥细胞的分化效率6，7。
总之，通过修改经典的分化方法，我们开发了一种可访问的方案，可以从人类RO中收集丰富的感光器前体和视锥细胞，以通过实验室调查分析与感光器相关的视网膜疾病，并用于进一步的临床应用/移植。
Protocol
Representative Results
Discussion
视网膜类器官分化是产生充足功能性视网膜细胞的理想方法。RO是由多能干细胞朝向神经视网膜4，5，8，9产生的不同视网膜细胞（例如神经节细胞，双极细胞和光感受器）的复合物。虽然可以收获汇合的RO，但它很耗时，可能需要很长的培养期（长达180天）。然而，对于感光器移植，或研究锥杆或视?…
Acknowledgements
我们感谢502实验室成员对稿件的技术支持和有益意见。这项工作得到了北京市自然科学基金（Z200014）和国家重点研发计划（2017YFA0105300）的部分支持。
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
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