אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים
Summary
באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.
Abstract
השתלת תאי רשתית היא גישה טיפולית מבטיחה, שיכולה לשחזר את ארכיטקטורת הרשתית ולייצב או אפילו לשפר את יכולות הראייה לרשתית המנוונת. עם זאת, ההתקדמות בטיפול בתחליפי תאים מתמודדת כיום עם האתגרים הדורשים מקור מדף של רשתיות אנושיות איכותיות וסטנדרטיות. לכן, יש צורך בפרוטוקול קל ויציב לניסויים. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על שיטת ארגון עצמי עם שימוש במולקולות אקסוגניות וריאגנט A, כמו גם כריתה ידנית ליצירת אורגנואידים תלת מימדיים של הרשתית האנושית (RO). RO שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) מבטא סמנים ספציפיים לפוטורצפטורים. עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב תכליתי, יעילות ההבחנה של מבשרי פוטורצפטור ומדוכים גדלה באופן משמעותי. השימוש היעיל במערכת זו, שיש לה את היתרונות של קווי תאים ותאים ראשוניים, וללא בעיות המקור הקשורות לאחרון, עלול לייצר תאי רשתית מפגשים, במיוחד פוטורצפטורים. לפיכך, ההתמיינות של PSCs ל-RO מספקת פלטפורמה אופטימלית ורלוונטית ביולוגית למידול מחלות, בדיקת תרופות והשתלת תאים.
Introduction
תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) מאופיינים בהתחדשות עצמית וביכולתם להתמיין לכל מיני תאים סומטיים. לפיכך, אורגנואידים שמקורם ב-PSCs הפכו למשאב חשוב במחקר ברפואה רגנרטיבית. ניוון הרשתית מאופיין באובדן פוטורצפטורים (מוטות ומדוכים) ואפיתל פיגמנט רשתית. החלפת תאי רשתית יכולה להיות טיפול מעודד למחלה זו. עם זאת, לא ניתן להשיג רשתיות אנושיות למחקר וטיפול במחלות. לכן, אורגנואידים של הרשתית (ROs) שמקורם ב-PSCs, אשר משחזרים ביעילות ובהצלחה תאי רשתית מקומיים רב-שכבתיים, מועילים למחקר בסיסי ותרגומי 1,2,3. המחקר שלנו מתמקד בהתמיינות RO כדי לספק תאים מספיקים ואיכותיים לחקר ניוון הרשתית4.
שיטות להבחנה בין ROs מתפתחות ללא הרף, עם דיפרנציאציה תלת מימדית (3D) מתלים חלוצה על ידי מעבדת Sasai בשנת 20125. הצגנו את התג CRX-tdTomato בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) כדי לעקוב באופן ספציפי אחר התאים המבשרים של הפוטורצפטור ושינינו את השיטה עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב-תכליתי של מסלולי Wnt, TGF-β ו-BMP6. הוכח כי COCO משפר ביעילות את יעילות ההתמיינות של מבשרי פוטורצפטורומדוכים 6,7.
בסך הכל, על ידי שינוי שיטת ההבחנה הקלאסית, פיתחנו פרוטוקול נגיש לקצירת מבשרי פוטורצפטור ומדוכים רבים מ- ROs אנושיים לניתוח מחלת הרשתית הקשורה לפוטורצפטורים באמצעות חקירות מעבדה ולהמשך יישום קליני / השתלה.
Protocol
Representative Results
Discussion
התמיינות אורגנואידית רשתית היא שיטה רצויה ליצירת תאי רשתית מתפקדים בשפע. ה-RO הוא תרכובת של תאי רשתית שונים, כגון תאי גנגליון, תאים דו קוטביים ופוטורצפטורים, הנוצרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים לכיוון הרשתית העצבית 4,5,8,9.</su…
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדת 502 על התמיכה הטכנית וההערות המועילות בנוגע לכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג’ינג (Z200014) ותוכנית המו”פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
