Gerichte inductie van retinale organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Met behulp van een zelforganiserende methode ontwikkelen we met de toevoeging van COCO een protocol dat de generatie van fotoreceptoren aanzienlijk zou kunnen verhogen.
Abstract
Retinale celtransplantatie is een veelbelovende therapeutische aanpak, die de retinale architectuur kan herstellen en de visuele mogelijkheden voor het gedegenereerde netvlies kan stabiliseren of zelfs verbeteren. Niettemin wordt de vooruitgang in celvervangingstherapie momenteel geconfronteerd met de uitdagingen van het vereisen van een kant-en-klare bron van hoogwaardige en gestandaardiseerde menselijke netvliezen. Daarom is een eenvoudig en stabiel protocol nodig voor de experimenten. Hier ontwikkelen we een geoptimaliseerd protocol, gebaseerd op een zelforganiserende methode met behulp van exogene moleculen en reagens A, evenals handmatige excisie om de driedimensionale human retina organoids (RO) te genereren. De van menselijke pluripotente stamcellen (PSC’s) afgeleide RO drukt specifieke markers voor fotoreceptoren uit. Met de toevoeging van COCO, een multifunctionele antagonist, wordt de differentiatie-efficiëntie van voorlopers en kegels van fotoreceptoren aanzienlijk verhoogd. Het efficiënte gebruik van dit systeem, dat de voordelen heeft van cellijnen en primaire cellen, en zonder de bronproblemen die met de laatste gepaard gaan, zou confluente retinale cellen kunnen produceren, vooral fotoreceptoren. De differentiatie van PSC’s naar RO biedt dus een optimaal en biorelevant platform voor ziektemodellering, geneesmiddelenscreening en celtransplantatie.
Introduction
Pluripotente stamcellen (PSC’s) worden gekenmerkt door hun zelfvernieuwing en het vermogen om te differentiëren in allerlei somatische cellen. Zo zijn organoïden afgeleid van PSC’s een belangrijke hulpbron geworden in onderzoek naar regeneratieve geneeskunde. Retinale degeneratie wordt gekenmerkt door het verlies van fotoreceptoren (staafjes en kegeltjes) en retinaal pigmentepitheel. Retinale celvervanging kan een bemoedigende behandeling zijn voor deze ziekte. Het is echter niet haalbaar om menselijke netvliezen te verkrijgen voor ziekteonderzoek en therapie. Daarom zijn retinale organoïden (RO’s) afgeleid van PSC’s, die effectief en met succes meerlagige inheemse retinale cellen recapituleren, gunstig voor fundamenteel en translationeel onderzoek 1,2,3. Ons onderzoek richt zich op RO-differentiatie om voldoende en kwaliteitscellen te leveren voor het bestuderen van retinale degeneratie4.
Methoden voor het differentiëren van RO’s zijn voortdurend in opkomst, met driedimensionale (3D) suspensiedifferentiatie die in 2012 door het Sasai-laboratorium werd gepionierd5. We introduceerden de CRX-tdTomato-tag in de menselijke embryonale stamcellen (hESCs) om specifiek de voorlopercellen van de fotoreceptor te volgen en pasten de methode aan met de toevoeging van COCO, een multifunctionele antagonist van de Wnt-, TGF-β- en BMP-routes6. Van COCO is aangetoond dat het de differentiatie-efficiëntie van fotoreceptorvoorlopers en kegels efficiënt verbetert 6,7.
Al met al hebben we, door de klassieke differentiatiemethode aan te passen, een toegankelijk protocol ontwikkeld om overvloedige voorlopers en kegels van fotoreceptoren van menselijke RO’s te oogsten voor het analyseren van de retinale ziekte geassocieerd met de fotoreceptoren door middel van laboratoriumonderzoek en voor verdere klinische toepassing / transplantatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retinale organoïde differentiatie is een wenselijke methode voor het genereren van ruime functionele retinale cellen. De RO is een samenstelling van verschillende retinale cellen, zoals ganglioncellen, bipolaire cellen en fotoreceptoren, gegenereerd door pluripotente stamcellen in de richting van het neurale netvlies 4,5,8,9. Hoewel confluente RO’s kunnen worden geoogst, is het tijdrovend, wat…
Acknowledgements
We bedanken de leden van het 502-laboratorium voor hun technische ondersteuning en nuttige opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) en het National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| COCO | R&D Systems | 3047-CC-050 | DAN Domain family of BMP antagonists |
| DMEM/F-12 | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| GMEM | Gibco | 11710-035 | |
| KnockOut Serum Replacement-Multi-Species | Gibco | A3181502 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | sigma | M7145 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Primesurface 96 V-plate | Sbio | MS9096SZ | Cell aggregation in 1.2.7 |
| Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Reagent A | BD | 356231 | Matrigel in 1.1.1 |
| Reagent B | StemCell | 5990 | mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2 |
| Reagent C | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2 |
| Reagent D | Roche | 11284932001 | DNase I , in 1.2 |
| Retinoic acid | Sigma | R2625-100MG | |
| SAG | Enzo Life Science | ALX-270-426-M001 | |
| Supplement 1 | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | organoids dissociation in 2.1.3 |
| Wnt Antagonist I, IWR-1-endo – Calbiochem | Sigma | 681669 | Wnt inhibitor |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 |
References
- Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).
- Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
- Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).
- Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
- Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
- Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).
- Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).
- Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
- Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286 (2015).
