Production de cellules CAR-T humaines conçues par CRISPR
Summary
Nous présentons ici un protocole d’édition de gènes dans les cellules T humaines primaires utilisant la technologie CRISPR Cas pour modifier les cellules CAR-T.
Abstract
Les thérapies cellulaires adoptives utilisant des cellules T réceptrices de l’antigène chimérique (cellules CAR-T) ont démontré une efficacité clinique remarquable chez les patients atteints de tumeurs malignes hématologiques et sont actuellement à l’étude pour diverses tumeurs solides. Les cellules CAR-T sont générées en retirant les cellules T du sang d’un patient et en les modifiant pour exprimer un récepteur immunitaire synthétique qui redirige les cellules T pour reconnaître et éliminer les cellules tumorales cibles. L’édition génique des cellules CAR-T a le potentiel d’améliorer l’innocuité des thérapies cellulaires CAR-T actuelles et d’augmenter encore l’efficacité des cellules CAR-T. Ici, nous décrivons les méthodes d’activation, d’expansion et de caractérisation des cellules CAR-T dirigées CD19 conçues par CRISPR chez l’homme. Cela comprend la transduction du vecteur lentiviral CAR et l’utilisation de l’ARN guide unique (SGRNA) et de l’endonucléase Cas9 pour cibler les gènes d’intérêt dans les cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être universellement appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles au-delà de ceux utilisés pour cette étude. En outre, ce protocole traite des stratégies de conception de l’ARNg, de la sélection de l’ARNg principal et de la validation de l’élimination du gène cible afin d’obtenir de manière reproductible une ingénierie CRISPR-Cas9 multiplexe à haute efficacité de cellules T humaines de qualité clinique.
Introduction
La thérapie cellulaire par récepteur de l’antigène chimérique (CAR)-T a révolutionné le domaine des thérapies cellulaires adoptives et de l’immunothérapie du cancer. Les cellules CAR-T sont des cellules T modifiées exprimant un récepteur immunitaire synthétique qui combine un fragment d’anticorps à chaîne unique spécifique à l’antigène avec des domaines de signalisation dérivés de la chaîne TCRzeta et des domaines costimulatoires nécessaires et suffisants pour l’activation et la co-stimulation des lymphocytes T1,2,3,4 . La fabrication de cellules CAR-T commence par l’extraction des propres cellules T du patient, suivie de la transduction virale ex vivo du module CAR et de l’expansion du produit des cellules CAR-T avec des billes magnétiques qui fonctionnent comme des cellules présentatrices d’antigènes artificiels5. Les cellules CAR-T expansées sont réinfusées dans le patient où elles peuvent se greffer, éliminer les cellules tumorales cibles et même persister pendant plusieurs années après la perfusion6,7,8. Bien que la thérapie par cellules CAR-T ait entraîné des taux de réponse remarquables dans les tumeurs malignes à cellules B, le succès clinique des tumeurs solides a été remis en question par de multiples facteurs, notamment une mauvaise infiltration des cellules T9,un microenvironnement tumoral immunosuppresseur10,la couverture et la spécificité de l’antigène et le dysfonctionnement des cellules CAR-T11,12 . Une autre limitation de la thérapie cellulaire CAR-T actuelle comprend l’utilisation de cellules T autologues. Après plusieurs cycles de chimiothérapie et une charge tumorale élevée, les cellules CAR-T peuvent être de mauvaise qualité par rapport aux produits CAR-T allogéniques de donneurs sains, en plus du temps et des dépenses associés à la fabrication de cellules CAR-T autologues. L’édition génétique du produit de cellules CAR-T par CRISPR/Cas9 représente une nouvelle stratégie pour surmonter les limites actuelles des cellules CAR-T13,14,15,16,17.
CRISPR/Cas9 est un système à deux composants qui peut être utilisé pour l’édition ciblée du génome dans les cellules de mammifères18,19. L’endonucléase Cas9 associée à CRISPR peut induire des cassures double brin spécifiques au site guidées par de petits ARN grâce à l’appariement de bases avec la séquence d’ADN cible20. En l’absence d’un gabarit de réparation, les ruptures double brin sont réparées par la voie d’assemblage d’extrémité non homologique (NHEJ) sujette aux erreurs, entraînant des mutations de décalage de trame ou des codons d’arrêt prématurés par des mutations d’insertion et de délétion (INDELs)19,20,21. L’efficacité, la facilité d’utilisation, la rentabilité et la capacité d’édition du génome multiplex font de CRISPR/Cas9 un outil puissant pour améliorer l’efficacité et la sécurité des cellules CAR-T autologues et allogéniques. Cette approche peut également être utilisée pour modifier les cellules T dirigées par TCR en remplaçant la construction CAR par un TCR. De plus, les cellules CAR-T allogéniques qui ont un potentiel limité de causer la maladie du greffon contre l’hôte peuvent également être générées par l’édition génique du locus TCR, b2m et HLA.
Dans ce protocole, nous montrons comment l’ingénierie CRISPR des lymphocytes T peut être combinée avec l’administration médiée par un vecteur viral du CAR-Transgene pour générer des produits de cellules CAR-T modifiés par le génome avec une efficacité et une sécurité accrues. Un diagramme schématique de l’ensemble du processus est illustré à la figure 1. En utilisant cette approche, nous avons démontré l’élimination de gènes à haute efficacité dans les cellules CAR-T humaines primaires. La figure 2A décrit en détail la chronologie de chaque étape de l’édition et de la fabrication des lymphocytes T. Des stratégies pour la conception d’ARN guide et la validation de l’élimination sont également discutées pour appliquer cette approche à divers gènes cibles.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici des approches pour modifier les gènes des cellules CAR-T à l’aide de la technologie CRISPR Cas9 et fabriquons des produits pour tester davantage la fonction et l’efficacité. Le protocole ci-dessus a été optimisé pour effectuer l’édition de gènes CRIPSR dans des cellules T humaines primaires combinées à des cellules T d’ingénierie avec des récepteurs d’antigènes chimériques. Ce protocole permet une efficacité élevée de knockout avec une variabilité minimale de donneur à don…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons le noyau d’immunologie humaine pour la fourniture de cellules T de donneurs normaux et le noyau de cytométrie en flux à l’Université de Pennsylvanie.
Materials
| 4D-Nucleofactor Core Unit | Lonza | AAF-1002B | |
| 4D-Nucleofactor X-Unit | Lonza | AAF-1002X | |
| Accuprime Pfx Supermix | ThermoFisher | 12344040 | |
| Beckman Optima XPN ultracentrifuge | Beckman Coulter | ||
| Brilliant Violet 605 anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317322 | Clone OKT3 |
| BV711 Anti-human PD1 | Biolegend | Clone EH12.2H7 | |
| Cas9-Electroporation enhancers | IDT | 1075915 | |
| CD3/CD28 Dynabeads | ThermoFisher | 40203D | |
| CD4+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15062 | |
| CD8+ T cell isolation Kit | StemCell technologies | 15063 | |
| Corning 0.45 micron vacuum filter/bottle | Corning | 430768 | |
| Corning T150 cell culture flask | Millipore Sigma | CLS430825 | |
| DMSO | Millipore Sigma | D2650 | |
| DNAeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| DynaMag Magnet | ThermoFisher | 12321D | |
| Glutamax supplement | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| huIL-15 | PeproTech | 200-15 | |
| huIL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| Lipofectamine 2000 | ThermoFisher | 11668019 | |
| Nucleospin Gel and PCR cleanup | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 31985062 | |
| P3 Primary cell 4D-nucleofactor X Kit L | Lonza | V4XP-3024 | |
| Penicilin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | |
| pTRPE expression Plasmid | in house | ||
| Rabbit Anti-Mouse FMC63 scFv Monoclonal Antibody, (R19M), PE | CytoArt | 200105 | |
| RPMI1640 | ThermoFisher | 12633012 | |
| sgRNA | IDT | ||
| Spy Fi Cas9 | Aldevron | 9214 | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| Viral packaging mix | in house | ||
| X-Vivo-15 Media | Lonza | BE02-060F |
References
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